Гиалуроновая кислота (гиалуронат) – это один из важнейших компонентов внеклеточных структур тканей, вещество, входящее в состав большинства биологических жидкостей и выполняющее целый ряд жизненно необходимых функций в человеческом организме. В теле молодого человека, весящего 70 кг, присутствует около 15 г данного соединения. При этом более трети его запасов ежедневно подвергается преобразованию (синтезируется или расщепляется).

Доказано, что с течением времени концентрация гиалуроновой кислоты в организме снижается. Так, например, в органах и тканях человека, достигшего 50-летнего возраста, присутствует на 30–40 % меньше этого соединения, чем в теле 17-летнего подростка. По этой причине современные диетологи рекомендуют каждому человеку, достигшему возраста 33–35 лет, увеличивать поступление этого вещества извне, то есть с пищевыми продуктами.

Впервые гиалуронат был выделен учеными К. Мейером и Д. Палмером из стекловидного тела коровьего глаза в 1934 году. Химическая структура этого соединения была определена значительно позже – во второй половине минувшего века. Что же касается медико-биологических свойств гиалуроновой кислоты, то их изучение продолжается до сих пор.

Биологические функции гиалуроната

Гиалуроновая кислота – это жизненно необходимое человеку вещество, выполняющее широкий спектр биохимических функций. На сегодняшний день доказано, что указанное соединение:

• является важнейшим составным компонентом эпителиальных, соединительных и нервных тканей, биологических жидкостей;
• повышает интенсивность натриевого, калиевого, магниевого обмена в клетках;
• поддерживает оптимальный жидкостный баланс во всех тканях человеческого тела;
• предотвращает преждевременное старение;
• ускоряет процессы регенерации за счет активизации секретирующей способности фибробластов (клеток, из которых состоят соединительные ткани);
• ускоряет процессы сращивания костных тканей при переломах и других повреждениях;
• придает вязкую консистенцию синовиальной жидкости;
• создает оптимальные условия для пролиферации (деления) и миграции клеток;
• улучшает микроциркуляцию крови;
• повышает скорость транспортировки полезных веществ по организму;
• защищает органы и ткани от травмирования при сдавливании;
• обеспечивает защиту кожных покровов от негативного действия прямых солнечных лучей;
• стимулирует процессы, отвечающие за синтез эластина и коллагена;
• оказывает выраженное противовоспалительное действие;
• входит в число компонентов, из которых состоят суставные хрящи, обеспечивает их нормальное функционирование;
• устраняет последствия внутренней интоксикации;
• защищает организм от микробов (активизирует бактерицидные факторы на раневой поверхности и на кожных покровах);
• изменяет активность лимфоцитов, укрепляя тем самым иммунитет человека;
• является антиоксидантом;
• способствует удалению из организма погибших клеточных структур и продуктов жизнедеятельности клеток;
• предотвращает развитие целого ряда офтальмологических заболеваний, является структурным элементом стекловидного тела человеческого глаза и входит в состав других элементов зрительного аппарата, способствует прохождению световых лучей к глазной сетчатке, не допуская при этом их искажения;
• препятствует появлению нарушений в работе суставов;
• является модулятором контуров лица и тела;
• обладает способностью удерживать влагу в кожных покровах, придает коже упругость, повышает ее устойчивость к влиянию неблагоприятных факторов и препятствует появлению возрастных и мимических морщин;
• оказывает благотворное влияние на работу репродуктивной системы;
• участвует в процессах внутриутробного развития и роста плода во время беременности.

Стоит отметить, что указанное соединение играет значимую роль и в процессе оплодотворения яйцеклетки. В норме ооцит, вышедший в периоде овуляции из яичника, покрыт двумя защитными оболочками (zona pellucida и corona radiata), содержащими большое количество гиалуроната. Оплодотворение его возможно только в том случае, если целостность этих оболочек не нарушена. При разрушении защитных слоев яйцеклетка теряет способность к оплодотворению сперматозоидами и погибает. Другими словами, недостаточное поступление гиалуроната в организм может стать причиной женского бесплодия.

В каких продуктах содержится гиалуроновая кислота?

В молодости организм человека способен синтезировать гиалуроновую кислоту и самостоятельно удовлетворять свою потребность в этом веществе. Однако с возрастом выработка данного соединения снижается, а его дефицит начинает оказывать отрицательное влияние на состояние кожи, суставов, на работу внутренних органов и систем. Одним из способов устранения неприятной симптоматики, сопровождающей нехватку гиалуроната, является включение в меню продуктов, богатых этим веществом или соединениями, стимулирующими его выработку.

Основным пищевым источником гиалуроновой кислоты считаются мясные продукты. При этом наибольшее количество этого вещества присутствует в тех сортах мяса (и блюдах, приготовленных на их основе), которые содержат достаточное количество суставов, сухожилий, хрящей и кожи. Так, например, восполнить утраченные запасы гиалуроната можно, регулярно включая в меню:

• наваристые мясные бульоны;
• отварное или тушеное мясо на кости;
• холодец, приготовленный на основе индейки, свинины, курицы или говядины;
• любые блюда, содержащие желатин (желе, мармелад, зефир и пр.).

Стоит отметить, что богатым источником гиалуроновой кислоты является и растительная пища. В частности, повышенные концентрации этого вещества были обнаружены в бобах сои, соевом молоке и овощах, содержащих большое количество крахмала. В конце XX века вещества, стимулирующие выработку гиалуроната, были обнаружены в кожице красного винограда. В результате в число растительных продуктов, позволяющих восполнить запасы этого уникального соединения в теле человека, были включены красные вина и натуральный виноградный сок.

Значительное количество гиалуроновой кислоты содержится и в некоторых лекарственных травах. В частности, богатым источником этого вещества признаны листья и плоды репейника, которые используют для приготовления полезных и вкусных травяных чаев.

Какие факторы влияют на синтез и усвоение гиалуроната в организме?

Существует несколько факторов, способных оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на процессы выработки и усвоения гиалуроновой кислоты. Так, например, синтез этого соединения и его усвояемость значительно повышаются при одновременном употреблении продуктов, обогащенных аскорбиновой кислотой и рутином. По этой причине диетологи рекомендуют лицам, страдающим от недостатка гиалуроновой кислоты, как можно чаще включать в свой рацион следующие продукты и блюда:

• зеленый чай;
• цитрусовые фрукты (лучше всего – грейпфруты, апельсины и лимоны);
• рябину;
• некоторые ягоды (ежевику, черную смородину, малину);
• грецкие орехи;
• абрикосы;
• черешню;
• зелень (петрушку, кинзу, укроп);
• все разновидности капусты;
• листовой салат;
• шиповник и приготовленные на его основе настои;
• томаты.

Одновременно с этим существуют факторы, которые могут существенно замедлять процессы выработки и всасывания гиалуроновой кислоты. Именно они и являются основными причинами развития дефицита этого вещества в организме.

Недостаток гиалуроновой кислоты и его последствия

Основными причинами формирования дефицита гиалуроновой кислоты в организме становятся:

• курение;
• злоупотребление спиртными напитками, имеющими повышенную крепость, употребление красного вина в дозах, превышающих допустимые (более 140 мл в течение дня);
• недостаточное поступление витамина C, рутина и других полезных веществ;
• чрезмерно долгое пребывание в солярии, под воздействием прямых солнечных лучей, отказ от использования солнцезащитных кремов;
• возрастное уменьшение концентрации данного вещества в тканях человеческого тела.

Недостаток этого соединения может повлечь за собой широкий ряд неблагоприятных последствий. В частности, признаками формирования дефицита гиалуроната могут явиться:

• ухудшение общего самочувствия, усталость, безразличие к происходящим событиям;
• ослабление иммунных сил организма, частое возникновение простудных заболеваний;
• обезвоживание, дряблость, чрезмерная сухость кожи;
• изменение контуров лица и тела в худшую сторону;
• развитие дерматологических заболеваний;
• ухудшение зрения и появление других нарушений в работе зрительного аппарата;
• раннее появление морщин и иных признаков старения организма;
• развитие болезней суставов и возникновение других патологий в работе опорно-двигательного аппарата;
• длительное заживление ран, медленное срастание костных тканей при переломах;
• появление признаков интоксикации организма;
• неспособность зачать ребенка в течение длительного времени;
• появление нарушений во внутриутробном развитии плода, замедление его роста.

При обнаружении подобных симптомов необходимо пересмотреть свой рацион и обогатить его продуктами, богатыми гиалуроновой кислотой и веществами, активизирующими ее синтез. Помимо этого, необходимо отказаться от вредных привычек и максимально оградиться от действия факторов, отрицательно сказывающихся на выработке этого незаменимого соединения.

Первое упоминание о необычном полисахариде с высокой молекулярной массой, который выделили из стекловидного тела бычьего глаза, было сделанo в 1934 году немецкими биохимиками Karl Meyer и John Palmer. Именнo они предложили назвать новое вещество гиалуроновой кислотой. Но еще в 1918 году Levene и Lopez - Suarez выделили из стекловидного тела и пуповинной крови полисахарид, состоявший из глюкозамина, глюкуроновой кислоты и небольшого количества сульфат-иoнов. Тогда его название было мукоитин - серной кислоты, но в настоящее время установилось, что это была гиалуроновая кислота, выделенная с примесью сульфатированных гликозаминогликанов .

В течение следующих 10 лет K. Meyer и ряд других ученых выделили гиалуроновую кислоту из органов животных. В 1937 г F. Kendall выделил гиалуроновую кислоту из капсул стрептококков .

Первый опыт применения ГК в медицине относится к 1943 г., когда советский врач Николай Федорович Гамалея использовал ее в комплексных повязках для обмороженных красноармейцев в военном госпитале. Экстракт из пуповины, названный им «фактором регенерации», был утвержден Минздравом СССР в качестве препарата «Регенератор». Так же венгерский ученый Андре Балаш с 1947 исследовал вязкость ГК в зависимости от pH и ионной силы раствора, ее расщепление под действием ультрафиолета, а также изучал, как гиалуроновая кислота действует на живые клетки .

В настоящее время гиалуронан как объект исследования можно встретить в биохимии, молекулярной биофизике, биоорганической и радиационной химии. Медицинские аспекты включают изучение роли гиалуроновой кислоты в оплодотворении, эмбриогенезе, выработки иммунного ответа, в заживлении ран, онкологических и инфекционных заболеваниях, процессах старения и в решении проблем эстетической медицины. Широкий спектр практического применения гиалурoновой кислоты способствует регенерации эпителия, предотвращает образование грануляционных тканей, спаек, рубцов, снижает отечность, уменьшает кожный зуд, нормализует кровообращение, способствует рубцеванию трофических язв, предохраняет внутренние ткани глаза. Достаточно хорошо гиалурoновая кислота используется в прикладной биохимии и энзимологии в качестве субстрата для количественного определения ферментов гиалуронидазнoго действия .

Что же представляет собой гиалуроновая кислота на самом деле? Это длинная неразветвленная молекула, в которой чередуются остатки D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Не вдаваясь в подробности, отметим, что оба эти вещества - это модифицированные молекулы глюкозы. Молекула гиалурoновой кислоты может содержать более 30 000 остатков каждого из этих веществ. Кроме того, в организме эта цепочка всегда связана с некоторым количеством белка. Интересно, что подобная структура универсальна и встречается у самых разных представителей животного мира и даже у некоторых бактерий. Гиалуроновая кислота относится к классу гликозаминогликанов .

Рисунок 1. Структура гиалуроновой кислоты

Ранее использовались методы получения гиалурoновой кислоты из стекловидного тела глаза коровы и гребешка петуха. Недостатками данных методов производства являлись их дороговизна и наличие примесей белка в конечном продукте, что приводило к большому количеству аллергических реакций на препарат.

Современное производство ГК основано на процессе ферментации с использованием бактерий (Streptococcus equi и Streptococcus zooepidemicus). ГК, полученная таким путем, имеет более высокую степень очистки, чем и объясняется лучшая переносимость ГК пациентами. Биотехнология получения гиалуронана из бактериальных штаммов продуцентов включает культивирование их в подбираемых условиях, при которых на стадии логарифмического роста на поверхности бактериальных клеток формируется капсула из полисахарида, а на стационарной стадии роста ГК может секретироваться в культурaльную жидкость, капсула истончается или полностью исчезает .

ГК чувствительна к кислотно-щелочному гидролизу. Даже слабое подкисление раствора ГК уксусной кислотой приводит к необратимому снижению вязкости в 2,5 раза. Минеральными кислотами ГК полностью гидрoлизуется до глюкурoновой кислоты, глюкoзамина, уксусной кислоты и двуокиси углерода. Разбавленная серная кислота за короткое время гидрoлизует кислоту с образованием кристаллов дисахаридов.

Окислительно-восстановительная деполимеризация гиалурoнана. Деструкция полисахаридной макромолекулы под действием окслительно-восстановительных сред протекает по свободнoрадикальному механизму. Свободные радикалы образуются с участием аскорбиновой кислоты, гиалуронана и кислорода. Доказано, что гиалурoновая кислота депoлимеризуется под действием ионов железа в присутствии аскорбиновой кислоты. Следовательно ГК, выделенная в атмосфере азота или аргона, имеет более высокую степень полимернoсти по сравнению с выделенной на воздухе .

Для медицинского применения необходима стерилизация растворов гиалуронана. Ее осуществляют автоклавированием при температуре 120-130ºС или ионизирующим гамма-излучением. В обоих случаях происходит значительная деполимеризация биополимера и потеря его исходной терапевтической активности. Известны способы защиты растворов гиалуронана от деполимеризации, основанные на добавлении к растворам различных аминокислот, борной кислоты и глицерина, сульфата гидрохинолина, мочевой кислоты, фенольных соединений (пирогаллол) .

Характерные свойства гиалуроновой кислоты – ее выраженная биологическая активность, прекрасная биосовместимость, отсутствие антигенности, раздражающего и других побочных эффектов – обратили на себя внимание ученых. Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам ГК нашла применение в различных областях медицины, косметологии и ветеринарии. Тот факт, что ГК входит в состав многих тканей (кожа, хрящи, стекловидное тело) и является органоспецифичной и видонеспецифичной, обуславливает ее применение в лечении заболеваний, связанных с этими тканями .

Биологические функции гиалуроновой кислоты можно разделить на «пассивные» и «активные». Как инертный материал, ГК участвует в гомеостазе тканей, в стерическом регулировании (осмосе) проникновения каких-либо субстанций, выполняет роль «смазки», улучшающей подвижность суставов и т.д. «Активные» функции ГК заключаются в специфическом связывании с белками в межклеточном матриксе и на поверхности клетки. Такое взаимодействие играет важную роль в образовании хрящевой ткани, в процессах клеточной пролиферации, в морфогенезе и эмбриональном развитии животных, а также в механизмах воспаления и возникновения рака .

Гиалуроновая кислота используется в онкологии как лечебное средство. Механизмы действия ГК на опухолевые клетки разнообразно. На молекулярном уровне механизм заключается в том, что высокомолекулярная ГК, связываясь с рецепторами на клеточной мембране опухолевых клеток, замедляет их миграцию и образование метастазов. Второй механизм действия состоит в том, что введение высокомолекулярной ГК способствует формированию соединительнотканной капсулы вокруг опухоли. Третий механизм связан со свойством высокомолекулярной фракции тормозить васкуляризацию опухоли (прорастание кровеносных сосудов в опухоль) и тем самым приводить к замедлению роста и метастазированию опухолей, а низкомолекулярной, наоборот, индуцировать .

Гиалуроновая кислота довольно хорошо проявила себя в заживлении ожоговых ран, язв, рубцов и послеоперационных вмешательств. Ученые выяснили, что она не имеет раздражающего действия, а даже наоборот вызывает противовоспалительный эффект, способствует быстрой регенерации ткани. Биоэксплантат (пленка) на основе окисленной ГК в эксперименте показал ускоренное заживление швов кишечных анастомозов повышенного риска.

ГК используют при приготовлении фармацевтических композиций в качестве загустителей, смазывающих веществ, агентов для пленочных покрытий, устойчивых к желудочному соку, в частности при получении капсул, гелей, коллоидов и различных устройств (например, контактных линз, предметов из марли и т.д.). Вероятно, в основе механизма накопления в соединительно-тканных структурах ряда лекарственных веществ и антибиотиков лежит связывание их с протеогликанами тканей. То же можно утверждать и о механизмах отложения в тканях, особенно в матриксе соединительной ткани, различных патологических продуктов. В норме в первые сутки заживления ран в них отмечается повышение концентрации ГК, которая связываясь с фибриновой сетью, образует переходный матрикс, стимулирующий активацию и миграцию гранулоцитов, макрофагов и фибробластов, пролиферацию эпителиальных клеток. Кроме того, ГК посредством усиления фагоцитоза способствует более полному очищению раны от некротических элементов. Вследствие усиления активности макрофагов увеличивается образование трофического фактора, который привлекает фибробласты и эндотелиальные клетки в пораженную область .

Содержание гиалуронана в коже человека не постоянная величина. Существуют незначительные сезонные колебания ГК в дерме: летом уровень гиалуронана несколько ниже, чем в зимний период. Это связывают с повышенной скоростью деградации ГК под действием УФ-излучения. Наиболее значимо возрастное уменьшение концентрации ГК. Начиная с 60-летнего возраста происходит кратное снижение концентрации ГК в дерме. Поэтому инъекционное внутриклеточное введение нативной ГК представляется вполне естественным способом воспаления ее дефицита. Данный инъекционный метод в эстетической медицине получил название биоревитализации .

В научной литературе можно встретить обширную информацию о химической структуре, макромолекулярной характеристики, биологических свойствах и медицинском применения гиалуроновой кислоты.

ГК входит в состав основного межклеточного вещества соединительной, эпителиальной и нервной тканей, в большом количестве присутствует в стекловидном теле глаза, синовиальной жидкости суставов, коже, стенках артерий и вен, сердечных клапанах, в глoмерулярной базальной мембране почек.

С момента открытия гиалурoновой кислоты произошла значительная эволюция взглядов. Если вначале считали, что данный полисахарид служит пассивным структурным компонентом межклеточного матрикса, то к настоящему времени он включен во многие биологические процессы: от размножения, миграции, дифференцировки клеток в процессе эмбриогенеза до регуляции процессов воспаления и заживления ран, метастазирования раковых клеток. В организме ГК выполняет множественные физиологические функции: служит основой функционирования системы организма, определяет проницаемость тканей и сосудов кровеносной системы, стойкость к проникновению инфекций . Но с возрастом все функции замедляются.

Такое широкое разнообразие биологических свойств гиaлуроновой кислоты обусловлено функцией молекулярной массы, которая играет значительную роль в поведении клеток, полиморфизмом структурных форм и физико-химическими свойствами молекул разной молекулярной массы, зависящими от ионного окружения и концентрации биополимера в тканях и органах .

Подводя итог, можно сказать, что гиалуроновая кислота нашла свое применение во многих отраслях медицины. Ее применяют в косметологических инъекциях (биоревитализация), входит в состав различных косметических средств. Следует отметить, что ГК может иметь и негативные последствия в частых инъекциях под кожу. Чтобы поддержать свою кожу в тонусе нужно вести здоровый образ жизни, правильно питаться и не злоупотреблять вредными привычками. Так же офтальмологи применяют ее в качестве лечения катаракты, синдрома «сухого глаза». В иммунологии применяют для комплексного лечения иммунодефицитных состояний при вирусных инфекциях. Так же можно использовать для лечения язвенных болезней желудка, двенадцатиперстной кишки, с помощью активации трипсина.

Список литературы

1. Егоров Е.А. Гиалуроновая кислота: применение в офтальмнологии и терапии синдрома «сухого глаза» // РМЖ. Клиническая офтальмология. – 2013. – Том 13, №2. С. – 72.
2. Сигаева Н.Н., Колесов С.В., Назаров П.В., Вильданова Р.Р. Химическая модификация гиалуроновой кислоты и ее применение в медицине // Вестник Башкирского университета. – 2012. – Т.17. №3. С. – 1221 – 1222.
3. Стрельникова Л.Н., Клещенко Е.В., Астрин А.В. Химия и жизнь // Ежемесячный научно – популяционный журнал. – 1.12.2010. №12. С. – 22 – 23.
4. Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине. – М.: Практическая медицина, 2012. – 224с.:ил. С. – 9 – 11, 19 – 30, 218.

Гиалуроновая кислота (hyaloid = стекловидный + uronic = кислота) – вещество, относящееся к группе полисахаридов, синтезируемое клетками большинства живых организмов, являющееся важным компонентом кожи, мышц, нервов и других тканей человека.

В описаниях составов косметических средств её иногда назывют «гиалурон», биохимики чаще употребляют словосочетание «гиалуронат натрия», поскольку в организме человека она присутствует в основном в форме натриевой соли.

Биологическая роль

Гиалуроновая кислота необходима для формирования межклеточного вещества, которое является средой для функционирования клеток: их деления, поступления к ним питательных веществ, выведения продуктов жизнедеятельности.

Половина всей гиалуроновой кислоты, находящейся в организме, содержится в коже. Здесь она является естественным заполнителем промежутков между волокнистыми элементами кожи – коллагеном и эластином , участвует в их синтезе.

Также гиалуроновая кислота задействована в процессах заживления ран, влияет на иммунные реакции, блокирует действие на клетки свободных радикалов, оберегая ткани от преждевременного старения.

Одним из важнейших свойств гиалуроновой кислоты является её высочайшая гидрофильность - способность связывать влагу. Одна её молекула способна удерживать до 500 молекул воды. Даже 1% водный раствор гиалуроновой кислоты уже не жидкость, а вязкий гель.

К чему приводит дефицит гиалуроновой кислоты?

С возрастом, под влиянием факторов окружающей среды и естественных процессов старения, содержание гиалуроновой кислоты в организме человека уменьшается, к 50-летнему возрасту её количество снижается вдвое. Снижение концентрации г.к. в коже приводит к её обезвоживанию, уменьшению синтеза в ней коллагена и эластина, что проявляется в виде сухости , дряблости , появлении морщин .

Применение в косметологии

В современной косметологии гиалуроновая кислота используется в качестве основного компонента препаратов для увлажнения кожи. Более эффективного вещества для этой цели ещё не найдено.

Поскольку гиалуроновая кислота не является чужеродным веществом для организма, препараты на её основе являются гипоаллергенными.

Гиалуроновая кислота, применяемая в косметологии, может быть как естественного, так и искусственного происхождения. Поскольку её метаболизм очень активен (молекула г.к. «живет» в организме 2-3 дня, затем она разрушается и клетками синтезируется новая) для введения в глубокие слои кожи чаще используется искусственно синтезированные вещества, отличающиеся тем, что в них молекулы г.к. «сшиты» между собой и для их расщепления организму требуется большее время.

В составе средств для наружного применения (кремов, эмульсий, лосьонов и др.) гиалуроновая кислота выступает в роли увлажнителя. Тончайшая пленка на поверхности кожи, образуемая ей, предотвращает чрезмерное испарение воды, задерживает необходимую влагу. При этом она не закупоривает поры кожи, не нарушает чрезкожный газообмен, способствует более глубокому проникновению других активных веществ, входящих в состав средства. Но, нанесенная на поверхность кожи, гиалуроновая кислота не проникает в её глубокие слои, обеспечивает лишь поверхностное, кратковременное увлажнение.

Для глубокого и долговременного увлажнения, для стимуляции фибробластов используется введение гиалуроновой кислоты в глубокие слои кожи - метод биоревитализации .

Препараты с высокой концентрацией гиалуроновой кислоты, имеющие гелеобразную форму, используются в контурной пластике – для коррекции носогубных складок, морщин, увеличения объема губ.

В препаратах для мезотерапии используется свойство гиалуроновой кислоты улучшать проникновение внутрь клеток других веществ, вводимых вместе с ней.

Гиалуроновая кислота используется не только в косметологии, она входит в состав лекарств, широко применяемых во многих областях медицины – офтальмологии, кардиологии, трансплантологии, хирургии и др.

В конце 80-х годов ХХ века врачи заметили, что процесс заживления ран во внутриутробном периоде происходит несколько иначе, чем после рождения. Для лечения врожденных аномалий развития хирургические операции проводили плодам, находящимся внутри тела беременных (на 2-6 месяце беременности). После родов на телах этих детей никаких следов проведенных операций не обнаруживалось. Ученые объясняют это очень большой концентрацией гиалуроновой кислоты в теле плода и амниотической жидкости, его окружающей.

Гиалуроновая кислота!О ней много говорят, ее включают в состав рецептур новых средств по уходу за кожей. Все производители косметики утверждают, что используют лучшие типы гиалуроновой кислоты в своих продуктах. Но что такое гиалуроновая кислота, что она делает, как она работает и какой ее тип считается лучшим?

Гиалуроновая кислота (ГК) – самый важный фактор гидратации кожи. Эта молекула образует трехмерную сеть, которая действует как губка и буквально улавливает воду вокруг и внутри своих складок.

Кроме того, ГК используется организмом в качестве смазки в суставах, из нее в основном состоит ушная раковина, она же один из структурных полимеров стекловидного тела глаза. ГК способна стимулировать или ингибировать воспаление, способствует заживлению ран и восстановлению кожного покрова. Она – важная составляющая межклеточного вещества буквально всей соединительной ткани человеческого организма.

В коже ГК находится главным образом в базальной мембране эпидермиса и дерме, поддерживая пространство между клетками, увлажняя и облегчая прохождение питательных веществ.

В организме женщины весом 60 кг содержится около 13 г гиалуроновой кислоты, 4,3 г из этого количества перерабатываются и обновляются каждый день.

Однако прежде чем обсуждать, как работает ГК и что она может сделать для кожи, было бы неплохо сначала представить короткое досье на это вещество для лучшего понимания способа его действия.

Гиалуроновая кислота 101

Гиалуронан, или гиалуроновая кислота, – это натуральный полимер, то есть большая молекула, состоящая из множества повторяющихся маленьких молекул-«субъединиц».

В случае гиалуроновой кислоты этой субъединицей является дисахарид D-глюкуроновая кислота и N-ацетил-D-глюкозамин, связанные вместе.

Длина молекулы ГК может составлять от 2 до 25 тыс. дисахаридов. Молекулярная масса этого природного полимера колеблется от 800 до 2 000 000 Дальтон (Да), при этом средняя молекулярная масса ГК составляет 3 МДа в суставах и около 2 МДа в коже.

Организм непрерывно синтезирует и разрушает ГК (как упоминалось выше, полная замена ГК в организме происходит примерно каждые три дня). По мере постепенной деградации больших молекул ГК образуются фрагменты самой разной молекулярной массы. Набор этих фрагментов – от 800 Да до 2 MДа – присутствует в любой момент времени в нормальных тканях.

По размерам молекулы ГК делятся на разные фракции.

• Очень высокая молекулярная масса: 3–20 MДа.
• Высокая молекулярная масса: ~ 2 MДа.
• Средняя молекулярная масса: ~ 1 MДа.
• Низкая молекулярная масса: ~ 300 кДа.
• Очень низкая молекулярная масса: ~ 60 кДа.
• Олигомеры: от 800 Да до10 кДа.

Внешний вид и биологические эффекты

Очевидно, что молекулы, молекулярная масса которых может различаться в 12 500 раз, выглядят и ведут себя в биологических системах совершенно по-разному, оказывая разные биологические эффекты. Это более подробно показано в многочисленных исследованиях, проведенных в последние годы.

Обычно говорят, что ГК может поглотить воды в 1000 раз больше ее собственного веса. Однако это относится только к высокомолекулярной ГК, а та, что имеет более низкую молекулярную массу, очевидно, способна поглощать гораздо меньше воды.

Поэтому на практике, если взять 1% высокомолекулярной ГК в воде, то можно получить довольно вязкую жидкость или жидкий гель. Низкомолекулярная ГК в той же концентрации будет гораздо менее вязкой жидкостью или совсем водянистым гелем, тогда как олигомер будет таким же жидким, как вода. Излишне говорить, что ГК с молекулярной массой 20 MДа будет в этом случае очень густым гелем.

Вы можете задаться вопросом, зачем столько информации о размерах молекул и внешнем виде геля. Ответ довольно интересен. ГК с молекулярной массой 3–20 MДа, то есть высокомолекулярная ГК, – это тот тип ГК, который обнаруживается при целлюлите. Это аномально большой размер молекул ГА, за счет чего происходит прочное удержание воды в подкожной жировой клетчатке, что в свою очередь способствует проявлению видимых признаков целлюлита.

Поэтому присутствие в тканях ГК со слишком высокой молекулярной массой нежелательно – это признак патологического процесса. С другой стороны, присутствие в тканях слишком большого числа ГК-фрагментов, то есть слишком большого количества олигомеров или даже ГК с молекулярной массой 20 кДа, также нежелательно, поскольку они, как известно, стимулируют воспаление. Однако даже воспаление в некоторых ситуациях имеет право на существование, и иногда это необходимо (например, при заживлении ран).

Все остальные молекулярные массы (50 кДа – 2 МДа) кажутся нейтральными или полезными, причем 2 МДа считается наиболее «нормальной» (если так можно выразиться) и препятствует воспалению.

Таким образом, мы можем утверждать, что единственный действительно «плохой» тип ГК – это ГК с чрезвычайно высокой молекулярной массой, которая также способствует фиброзу.

Диета, образ жизни и гиалуроновая кислота

Предполагается, что диета, богатая овощами (магний) и фруктами (аскорбиновая кислота), помогает повысить естественный синтез ГК в организме. Также некоторые продукты богаты ГК или ее предшественниками. В качестве примера можно привести костный бульон, мясные субпродукты и суставной хрящ.

Гиалуронан можно также принимать внутрь в виде пищевой добавки, и он действительно «достигает» кожи и суставов, помогая увеличить их гидратацию, дольше сохранить молодость и поддержать здоровье. Это похоже на пероральный прием гидролизованного коллагена, что также помогает отсрочить старение кожи, сохранить упругость и эластичность связок и сухожилий.

Ультрафиолетовое излучение уменьшает содержание ГК в коже, что приводит к ее сухости и воспалению. Обеспечив кожу достаточным количеством ГА летом, в том числе «изнутри», мы можем быть уверены, что она сможет оставаться увлажненной и защищенной от солнечных лучей.

Нет никакой специфической пищи, которая обладала бы доказанной способностью увеличивать собственный синтез ГК в организме, но ежедневное употребление определенного количества питьевой воды будет способствовать гидратации, поскольку молекула воды не менее важна для этого, чем гиалуроновая кислота, ведь без воды гиалуронан абсолютно бесполезен. В идеале необходимо выпивать два литра воды в день. Таким образом, для улучшения увлажнения кожи и получения омолаживающего эффекта целесообразно комбинировать оральное применение ГК в виде БАД и употребление достаточного количества воды. Для максимального результата можно дополнительно использовать качественную сыворотку, гель или крем, содержащие ГК.

Кожная абсорбция ГК из косметических рецептур

Поскольку ГК стимулирует репарацию и увлажнение кожи, а кожа производит ее все меньше и меньше по мере старения, само собой разумеется, хочется добавить немного ГК в кожу в виде косметической сыворотки, крема или геля.

Понятно, что ГК с большой молекулярной массой не сможет даже проникнуть в эпидермис, в то время как все, что ниже 300 кДа, проникает в дерму и даже подкожно-жировую клетчатку. Чем ниже молекулярная масса, тем глубже ГК может проникать в кожу.

Однако не все так просто. Как мы уже упоминали выше, нужно понимать, для чего мы используем в своей рецептуре ГК с более низким молекулярным весом. «Проталкивая» ГК с молекулярным весом 20 кДа в кожу, мы вовсе не решаем всех проблем кожи, поскольку для нее это может оказаться как полезным, так и раздражающим воздействием. В случае использования ГК с чрезвычайно низкой молекулярной массой все осложняется еще больше.

Однако в большинстве исследовательских работ показано, что молекулы ГК с молекулярной массой где-то между 50 и 300 кДа хорошо проникают в кожу и оказывают на нее благотворное влияние. Мой личный опыт тоже говорит о том, что это лучший для использования диапазон молекулярных масс.

ГК с молекулярной массой 1 MДа может гидратировать сам эпидермис, не проникая дальше, в то время как молекула с молекулярной массой 2MДа просто сидит на поверхности эпидермиса и больше никуда не идет. С другой стороны, я обнаружил, что ГК с молекулярной массой 10 кДа не так полезна и в высоких концентрациях может раздражать кожу, что подтверждается данными, приведенными в научной литературе.

Столь разная абсорбционная способность ГК, зависящая от ее молекулярной массы, является причиной того, что все больше косметических компаний в настоящее время в рецептурах используют ГК разного молекулярного веса.

Молекулы ГК также могут быть линейными или сшитыми. Линейная молекула – это стандартная ГК, встречающаяся в организме человека и в природе. Сшитая ГК представляет собой изобретение человека, это более стабильная форма ГК с более высокой гидратирующей способностью. Но, к сожалению, сшитая ГК обладает меньшей способностью проникать в кожу, поскольку молекула «более толстая» и не может легко пересечь эпидермис.

Сшитая ГК используется в качестве филлера в мезотерапии, но сегодня ее также можно встретить в составе некоторых антивозрастных кремов.

Сыворотки, гели и кремы

Достаточно легко получить косметическую сыворотку или гель, используя ГК и воду. Однако кремы – это другое дело. Здесь ГК может сильно увеличить нестабильность эмульсионной системы. Поэтому большинство продуктов с ГК на рынке – это гели и сыворотки, которые легче получить.

Многие представленные на рынке косметические средства с ГК содержат около 0,1% этого вещества, то есть 1 часть ГК и 999 частей воды и некоторых других ингредиентов. Однако более концентрированные продукты могут содержать до 2% ГК. Более высокие концентрации нецелесообразны, поскольку крем или гель становятся слишком густыми и неудобными.

Гиалуроновая кислота в настоящее время – один из самых популярных и важных ингредиентов для борьбы со старением кожи и в уходе за лицом. Ее также можно встретить в некоторых средствах для ухода за телом. К сожалению, если тип и концентрация ГК специально не упоминаются на упаковке косметического средства, очень сложно понять, что именно и в каких концентрациях в нем используется, но это относится ко всем ингредиентам косметических рецептур.

С другой стороны, некоторые продукты для ухода за кожей включают в себя активные вещества, которые повышают собственный синтез ГК в коже. Это дает несколько отсроченный результат, но обходит проблему абсорбции ГК, поскольку «собственная» ГК синтезируется внутри кожи. Другие активные вещества, используемые в косметике, могут ингибировать в человеческом организме действие разрушающих ГК ферментов – гиалуронидаз (большинство полифенолов обладает такой активностью). Это продлевает срок полезного использования ГК в коже и подавляет ее раннюю или чрезмерную деградацию.

Каково происхождение ГК для косметики?

Когда-то давно в косметике использовали ГК животного происхождения, получаемую из свиных ушей или петушиных гребней. Я помню, что первая ГК, которую мы купили для использования в наших продуктах в 2002 году, была получена из поросят.

Сегодня ГК производится путем бактериальной ферментации, что позволяет получить стандартный размер молекул – 2 MДa. Затем ее «разрезают» либо ферментами, либо гидролизом и получают молекулы меньшего размера. В организме человека происходит то же самое – ГК с молекулярной массой 2 MДа разрезается на более «мелкие кусочки» ферментами, называемыми гиалуронидазами.

Гиалуронидаза и целлюлит

Иногда, чтобы разрушить ГК с чрезмерно высокой молекулярной массой, о которой мы упоминали выше, врачи вводят в ткани гиалуронидазу.

Одно из таких применений гиалуронидазы – временное сокращение признаков целлюлита. Я использую слово «временное», потому что человеческий организм может восстановить молекулярную массу только что синтезированной ГК до 20 MДа всего за несколько дней.

Таким образом, долгосрочное решение проблемы целлюлита не может быть достигнуто инъекциями гиалуронидазы. Это должны быть меры, в первую очередь направленные на снижение удержания воды в тканях и уменьшение синтеза ГК с молекулярной массой 20 MДa. Но это история для другой статьи…

Заключение

По мере старения в организме человека синтезируется все меньше и меньше ГК, в связи с чем необходимо защитить уже имеющуюся ГК и увеличить ее содержание в коже.

Это можно сделать, избегая чрезмерного воздействия солнца; с помощью диеты, богатой овощами, травами, субпродуктами; выпивая достаточное количество воды; используя хорошие косметические средства для ухода за кожей на основе ГК с молекулами разных молекулярных масс, в идеале – от 50 до 300 кДа.

Биологически активные добавки с гиалуроновой кислотой также помогают, поскольку действительно оказывают благотворное влияние на кожу (и суставы), помогая увлажнять и питать организм «изнутри».

Гиалуроновая кислота [ГК] найдена во внеклеточном матриксе позвоночных тканей, в поверхностном покрытии определенных видов Streptococcus и болезнетворных бактериальных микроорганизмов Pasteurella, а также на поверхности некоторых частично пораженных вирусом морских водорослей. Синтазы гиалуроновой кислоты [ГКС], это ферменты, которые полимеризуют ГК, используя UDP-сахарные предшественники, которые найдены во внешних мембранах этих организмов. Были идентифицированы гены ГКС из всех вышеупомянутых источников. Кажется, существуют два отличных класса ГКС, что основано на различиях в аминокислотной последовательности, предсказанной топологии в мембране и предполагаемом механизме реакции.

Все ГКС были определены как синтазы класса I, за исключением ГКС у вида Pasteurella. Был также объяснен каталитический способ работы единственной ГКС класса II (пмГКС). Этот фермент удлиняет внешние ГК-присоединяемые олигосахаридные акцепторы путем добавления индивидуальных моносахаридных единиц к неуменьшающемуся концу, чтобы сформировать длинные полимеры in vitro; ни одна ГКС класса I не имеет такой способности. Способ и направление полимеризации ГК, катализируемой ГКС класса I, остаются неясными. Фермент пмГКС также был проанализирован на предмет двух имеющихся у него активностей: GlcUA-трансферазной и GlcNAc-трансферазной. Таким образом, два активных участка существуют в одном пмГКС полипептиде, опровергая широко принятую догму гликобиологи: "один фермент - один модифицированный сахар". Предварительные свидетельства позволяют предполагать, что у ферментов класса I может также быть два участка активности.

Каталитический потенциал фермента пмГКС может использоваться, чтобы создать новые полисахариды или проектировать олигосахариды. Из-за множества потенциальных ГК-базирующихся медицинских методов лечения, эта хемоэнзиматическая технология обещает принести пользу на пути нашего стремления к хорошему здоровью.

Ключевые слова

Гиалуроновая кислота (ГК), хондроитин, гликозилтрансфераза, синтаза, катализ, механизм, химерные полисахариды, монодисперсные олигосахариды

Введение

Гиалуронан [ГК] - очень богатый глюкозаминогликан в организме позвоночных, имеющий и структурную, и сигнальную роли. Определенные патогенные бактерии, а именно, группы А и С вида Streptococcus и тип А Pasteurella multocida, производят внеклеточный покрывающий ГК, называемый капсулой. У обоих видов ГК капсула и является фактором ядовитости, который обеспечивает бактериям сопротивляемость фагоцитам и комплементарность. Другой организм, производящий ГК - это морская водоросля хлорелла, инфицированная определенным большим двухцепочечным ДНКовым вирусом PBCV-1. Роль ГК в жизненном цикле этого вируса пока не ясна на данный момент.

Иллюстрация 1. Реакция биосинтеза ГК.

Ферменты класса гликозилтрансфераз, которые полимеризируют ГК, называются ГК-синтазами (или ГКС), по старой терминологии, включающей также ГК-синтетазы. Все известные ГК-синтазы - это разновидности одного полипептида, ответственные за полимеризацию цепи ГК. UDP-сахарные предшественники, UDP-GlcNAc и UDP-GlcUA используются ГК-синтазами в присутствии двухвалентного катиона (Mn и/или Mg) при нейтральном pH (рис. 1). Все синтазы являются мембранносвязанными белками в живой клетке и обнаружены в мембранной фракции после лизиса клеток.

Между 1993 - 1998 были идентифицированы и клонированы на молекулярном уровне ГК-синтазы групп A и С Streptococcus [спГКС и сеГКС соответственно], ГК-синтазы позвоночных животных [ГКС 1,2,3], ГК-синтаза водорослевого вируса [свГКС], а также ГК-синтаза типа A вида Pasteurella multocida [пмГКС]. Первые три типа ГК-синтаз, кажется, очень похожи в размере, аминокислотной последовательности и предсказанной топологии в мембране. ГК-синтаза вида Pasteurella, напротив, больше и обладает существенно отличающейся от других синтаз последовательностью и предсказанной топологией. Поэтому, мы предположили существование двух классов ГК-синтаз (таблица 1). Ферменты класса I включают стрептококковые, позвоночные и вирусные белки, в то время как белок вида Pasteurella в настоящее время единственный член класса II. У нас также есть некоторые свидетельства того, что каталитические процессы ферментов класса I и класса II отличаются.

Таблица 1. Два класса ГК-синтаз:

Хотя ГК-синтаза вида Pasteurella был последним обнаруженным ферментом из всех, некоторые особенности пмГКС способствовали существенному продвижению в его изучении в сравнении с некоторыми членами ферментов класса I, которые исследовались четыре десятилетия. Ключевая особенностью пмГКС, которая позволила разъяснить молекулярное направление полимеризации и идентификацию ее двух активных участков - это способность пмГКС удлиннять внешне расположенный акцепторный олигосахарид. Рекомбинантная пмГКС добавляет одиночные моносахариды повторным способом к ГК-ассоциированному олигосахариду in vitro. Внутренняя особенность каждой передачи моносахарида ответственна для того, чтобы формировать альтернативное повторение дисахаридов в этом глюкозаминогликане; одновременное формирование дисахаридной единицы не требуется. С другой стороны, никакое подобное удлиннение внешних акцепторов не было доказано ни для какого фермента класса I. Через фундаментальное научное исследование мы теперь развили некоторые биотехнологические применения замечательного белка класса ГК-синтаз вида Pasteurella.

Материалы & методы

Реагенты

Все реактивы для молекулярнобиологических исследований без специальной пометки были от Promega. Стандартные олигонуклеотиды были от Great American Gene Company. Все другие реактивы высокой чистоты, если иначе не отмечено, были от Sigma или от Fisher.

Усечение пмГКС и точечные мутанты

Был произведен ряд усеченных полипептидов, путем амплификации pPm7А вставки методом полимеразной цепной реакцией с Taq-полимеразой (Fisher) и синтетическими олигонуклеотидными праймерами, соответствующими различным частям пмГКС, с открытой рамкой считывания. Ампликоны затем были клонированы в плазмиду для экспрессии pKK223-3 (tac промотор, Pharmacia). Получившимися рекомбинантными конструкциями были трансформированы клетки Escherichia coli штамма TOP 10F" (Invitrogen) и выращены на среде LB (Luria-Bertani) с ампициллиновой селекцией. Мутации были сделаны, используя метод QuickChange сайт-направленного мутагенеза (Stratagene) с плазмидой pKK/пмГКС как ДНК шаблон.

Приготовление фермента

Для приготовления мембраны, содержащей рекомбинантный пмГКС полной длины, пмГК1-972 был изолирован из E.coli, как описано. Для растворимых усеченных пмГКС белков, пмГКС1-703, пмГКС1-650 и пмГКС1-703 - содержащих мутантов, клетки были извлечены с помощью В-PerТМ II Bacterial Protein Extraction Reagent (Pieree) согласно инструкции производителя, за исключением того, что процедура была выполнена при 7°C в присутствии ингибиторов протеаз.

Ферментные пути полимеризации ГК. GlcNAc модификация или GlcUA модификация

Три варианта было разработано, чтобы обнаружить происходит ли (а) полимеризация длинных цепей ГК или (b) добавление одиночного GlcNAc к GlcUA-конечному акцепторному олигосахариду ГК , или (c) добавление одиночного GlcUA к GlcNAc-конечному акцепторному олигосахариду ГК . Полная активность ГКС была оценена для раствора, содержащего 50 mM Tris, pH 7.2, 20 mM MnCl2, 0.1 M (NH4)2SO4, 1 M этиленгликоля, 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.01 μCi; NEN), 0.3 mM UDP-GlcNAc и различный набор ГК олигосахаридов, полученный из тестикул путем обработки гиалуронидазой [(GlcNAc-GlcUA)n, n= 4-10] при 30°C в течение 25 минут в объеме реакционной смеси 50 мкл. GlcNAc-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же буферной системе с различным набором ГК олигосахаридов, но только с одним сахаром в роли предшественника - 0.3 mM UDP-(3H)GlcUA (0.2 μCi; NEN). GlcUA-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же самой буферной системе, но только с 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.02 μCi) и с нечетным набором ГК олигосахаридов (3.5 мкг уроновой кислоты), приготовленных при помощи воздействия ацетата ртути на ГК-лиазу Streptomyces. Реакции были прекращены путем добавления SDS до 2% (w/v). Продукты реакции были отделены от субстратов путем бумажной (Whatman 3M) хроматографии с этанолом/1 М сульфат аммония, pH 5 5, как основной растворитель (65:35 для ГКС и оценки GlcUA-Tase; 75:25 для оценки GlcNAc-Tase). Для оценки ГКС образец бумажной полосы был промыт водой, и объединение радиоактивных сахаров в полимер ГК было обнаружено по сцинтилляции жидкости, рассчитанной при помощи BioSafe II коктейля (RPI). Для реакций полуиспытания образец и расположенные вниз по течению 6 см полосы были посчитаны по частям в 2 см. Все оценочные эксперименты были просчитаны таким образом, чтобы быть линейными относительно времени инкубации и концентрации белка.

Гель-фильтрационная хроматография

Размер ГК полимеров был проанализирован хроматографически на колонках Phenomenex PolySep-GFC-P 3000, элюция производилась 0.2 M нитратом натрия. Колонка была стандартизована флуоресцентными декстранами различного размера. Радиоактивные компоненты были обнаружены с помощью датчика LB508 Radioflow (EG & G Berthold) и коктейля Zinsser. По сравнению с полной оценкой ГКС, используя бумажную хроматографию, описанную выше, эти 3-минутные реакции содержали дважды UDP-сахарные концентрации, 0.06 μCi UDP-(14C)GlcUA и 0.25 нанограмма ряда ГК олигосахаридов. Кроме того, использовалось добавление кипящего (2 минуты) этилендиамина тетрациловой кислоты (финальная концентрация 22 mM), чтобы закончить реакции вместо добавления SDS.

Результаты и обсуждение

Утилизация и специфичность акцептора ГКС

Некоторые олигосахариды были проверены, в качестве акцепторов для рекомбинантного пмГКС1-972(Таблица 2). ГК олигосахариды были получены из тестикул путем гиалуронидазного щепления, а удлиннены пмГКС с помощью доставляемых подходящих UDP-сахаров. Восстановление борогидратом натрия не нарушает активность акцептора. С другой стороны, олигосахариды, полученные из ГК при помощи отщепления лиазой, не поддерживают удлиннение; дегидратированные ненасыщенные невосстановленные концевые остатки GlcUA нуждаются в гидроксильных группах, которые смогли бы присоединить входящий сахар из UDP-предшественника. Поэтому пмГКС-катализируемое удлиннение происходит в случае невосстановленных концевых групп. В ряде параллельных экспериментов было обнаружены рекомбинантные формы синтаз класса I - спГКС и х1ГКС, которые не удлинняют ГК-получаемые акцепторы. Принимая во внимание направление активности ферментов класса I, противоречивые сообщения были сделаны и необходимы дальнейшие исследования.

Таблица 2. Специфика олигосахаридных акцепторо пмГКС:

Интересно, что хондроитин сульфат пентамер является хорошим акцептором для пмГКС. Другие структурно связанные олигосахариды такие, как хитотетроза или хепарозан пентамер, однако, не служат акцепторами для пмГКС. В целом, пмГКС, кажется, требует, β-связанных GlcUA-содержащих акцепторных олигосахаридов. Мы выдвигаем гипотезу, что участок связывания олигосахаридов промежуточен в цепи удерживания ГК во время полимеризации.

Молекулярный анализ активности пмГКС трансферазы: два активных участка в одном полипептиде

Возможность измерить два компонента гликозилтрансферазной активности ГК синтазы, GlcNAc-трансфераза и GlcUA-трансфераза, позволил молекулярный анализ пмГКС. Мы отметили, что короткий дублированный мотив последовательности: Asp-Gly-Ser (Аспарагиновая к-та-Глицин-Серин), присутствовал в пмГКС. Из анализа сравнения гидрофобных групп многих других гликозилтрансфераз, которые производят β-связанные полисахариды или олигосахариды предположили, что вообще, существует два типа доменов: области "A" и "Б". ПмГКС, синтаза класса II, тем и уникальна, что содержит два "А" домена (личная коммуникация, B.Henrissat). Было предложено, что определенные члены класса I ГК синтаз (спГКС) содержат одиночные "А" и одиночные "Б" области. Различное удаление или точечные мутанты пмГКС были оценены для их способности полимеризовать ГК цепи или их способность добавлять одиночный сахар к ГК акцепторному олигосахариду (Таблица 3). Суммируя сказанное, пмГКС содержит два отличных друг от друга активных участка. Мутагенез аспартата мотива DGS (остаток 196 или 477) по обоим сайтам приводи к потере ГК полимеризации, но активность другого сайта оставалась относительно незатронутой. Таким образом, двойная активность ГК синтазы была преобразована в два различных одиночных действия гликозилтрансферазы.

Таблица 3. Активность пмГКС с удаленным участком или точечной мутацией.

Удаление последних 269 остатков от конечной карбоксильной группы преобразовало слабо выраженный мембранный белок в хорошо выраженный растворимый. Рассмотрение аминокислотной последовательности белка пмГКС в этой области, однако, не показывает типичных особенностей вторичной структуры, которые обеспечили бы прямое взаимодействие фермента с двойным слоем липида. Мы выдвигаем гипотезу, что конечная карбоксильная группа каталитического фермента пмГКС стыкуется с направляющим мембраносвязанным полисахарида транспортного аппарата живущей бактериальной клетки.

Первая "A" область пмГКС, А1, является GlcNAc-тазой, в то время как вторая "A" область, A2, является GlcUA-тазой (рис. 2). Это - первая идентификация двух активных участков для фермента, который производит гетерополисахарид, так же как ясное доказательство, что один фермент может действительно передать два различных сахара. Отличный от типа F фермент вида P. multocida, названный пмЦС, был найден, и вяснено, что он катализирует формирование несульфатируемого полимера хондроитина. ГК и хондроитин идентичны в структуре, за исключением упомянутого выше полимера, который содержит N-ацетилглюкозамин вместо GlcNAc. И пмГКС, и пмЦС на 87 % идентичны на уровне аминокислот. Большинство изменений в остатках находятся в области А1, что вполне совместимо с гипотезой о том, что эта область ответственна за передачу гексозамина.

Иллюстрация 2. Схематическое изображение пмГКС областей.
Два независимых трансферазных домена, А1 и A2, ответственны за катализ полимеризации цепи ГК. Повторяющиеся последовательные добавления одиночных сахаров быстро строят цепь ГК. Похоже, что карбоксильный конец пмГКС некоторым способом взаимодействует с мембранносвязанным транспортным аппаратом бактериальной клетки.

Иллюстрация 3. Модель биосинтеза ГК при помощи пмГКС.
Одиночные сахара добавляются к каждому "A" домену повторным способом к невосстанавливающемуся концу цепи ГК. Внутренняя точность каждой стадии активности трансферазы поддерживает повторение структуры дисахаридов ГК. Возникающая цепь ГК вероятно сохраняется пмГКС во время катализа через олигосахарид-связывающий участок.

Мы продемонстрировали эффективную передачу одиночного сахара с помощью пмГКС in vitro несколькими типами экспериментов, поэтому, мы выдвинули гипотезу, что цепи ГК формируются быстрым, повторяющимся добавлением одиночного сахара синтазой класса II (рис. 3). К настоящему времени, одна линия свидетельства предполагает, что фермент класса I также обладает двумя участками трансферазы. Мутация лейцинового остатка 314 на валин в ммГКС1, в части предварительного участка GlcUA-тазы, как сообщали, преобразовала эту ГКС позвоночного животного в хито-олигосахаридную синтазу. Ни один участок с соответствующей активностью GlcNAc-трансферазы не был идентифицирован.

Прививание полимера полисахаридными синтазами: добавление ГК к молекулам или твердым частицам

Исследование пмГКС в научно-исследовательской лаборатории преобразовало представления о ГК синтазах от царства трудных, упорных животноподобных чудовищ до потенциальных биотехнологических рабочих лошадок. Новые молекулы могут быть сформированы, используя способность пмГКС привить длинные цепи ГК на коротких ГК полученных цепях или хондроитин-производных акцепторах. Например, полезные акцепторы могут состоять из маленьких молекул или лекарств с ковалентно связанной ГК или хондроитин-олигосахаридные цепи (длиной в 4 сахара, например). В другом случае, цепи ГК могут быть добавлены к олигосахаридному праймеру, иммобилизованному на твердой поверхности (таблица 4). Таким образом, длинные цепи ГК могут быть мягко добавлены к чувствительным веществам или тонким устройствам.

В другом приложении, новые химерные полисахариды могут быть сформированы потому, что использование пмГКС олигосахаридным акцептором не столь же строго, как сахаридная трансферазная специфика. Хондроитин и хондроитин-сульфат признаны как акцепторы пмГКС и удлинняются ГК цепью различных длин (рис. 4). Наоборот, пмЦС очень гомлогичная хондроитин синтазе, распознает и удлинняет ГК акцепторы цепями хондроитина. Химерные молекулы глюкозаминогликана сформированы, содержа естественные, определенного соединения связи. Эти привитые полисахариды могут служить, чтобы присоединиться к клетке или ткани, которая связывает ГК с другой клеткой или ткань, связывающей хондроитин или хондроитин-сульфат. В определенных аспектах, привитые глюкозаминогликаны напоминают протеогликаны, которые являются существенными компонентами матрикса в тканях позвоночных. Но так как никакие компоновщики белка не присутствуют в химерных полимерах, то антигенность и проблемы протеолизиса, возникающие вокруг медицинского использования протеогликанов, устранены. Риск передачи инфекционных агентов тканями, извлеченными из животных, человеческому пациенту также уменьшен при использовании химерных полимеров.

Таблица 4. ПмГКС-инициированное прививание ГК на бусинки полиакриламида. Реакционная смесь содержит пмГКС, несущий радиоактивную метку UDP-(14C)GlcUA и UDP-(3H)GlcNAc, а также различные иммобилизованные праймеры сахаров (акцепторы, соединенные восстановительным аминированием в аминобусины) были представлены. Бусинки были промыты и радиоактивно инкорпорированы на другие бусины, измеренные методом расчета жидкостной сцинтилляции. ГК цепи были привиты на пластиковые бусины при использовании подходящего праймера и пмГКС.

Иллюстрация 4. Схематическое изображение привитых полисахаридных структур. ГК синтаза вида Pasteurella или хондроитин синтаза будут удлиннять определенные другие полимеры на невосстанавливающемся конце in vitro, чтобы сформировать новые химерные глюкозаминогликаны. Изображены некоторые примеры.

Синтез монодисперсной ГК и ГК-связанных олигосахаридов

В дополнение к добавлению большой полимерной ГК цепи к молекулам акцептора, пмГКС синтезируют определенные меньшие ГК олигосахариды в диапазоне от 5 до 24 сахаров. Используя фермент дикого типа и различные условия реакции, был относительно легко получен ГК олигосахарид, содержащий 4 или 5 моноахаридов, удлиненных несколькими сахарами до более длинных версий, которые очень часто трудно получить в больших количествах. Мы выяснили, что, комбинируя растворимый мутант GlcUA-Tase и растворимый мутант GlcNAc-Tase в той же самой смеси реакции позволяет формирование ГК полимера, если система снабжена акцептором. В течение 3-х минут была сделана цепь из примерно 150 сахаров (-30 кДа). Любая одиночная мутант-синтаза не сформирует в результате цепь ГК. Поэтому, если дальнейший контроль реакции сделан путем выборочного комбинирования различных ферментов, UDP-сахаров и акцепторов, то могут быть получены определенные монодисперсные олигосахариды (рис. 5).

Иллюстрация 5. Приготовление определенных олигосахаридов.
В этом примере, акцептор ГК тетрасахарид удлинняется одиночной хондроитин дисахаридной единицей, используя два шага с иммобилизованным мутантом синтазы вида Pasteurella (показано белыми стрелками). Изображенный продукт является новым гексасахаридом. Повторение цикла еще раз производит олигосахарид, два цикла формируют декасахарид, и т.д. Если акцептор был ранее соединен с другой молекулой (например препарат или лекарство), тогда новый конъюгат был бы удлиннен коротким ГК, хондроитином или гибридной цепью как и желательно.

Например, в одном воплощении, смесь UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA и акцептора постоянно циркулирует через отдельные биореакторы с иммобилизованными мутант-синтазами, которые передают только одиночный сахар. С каждым циклом инкубации биореактора другая сахарная группа добавляется к акцептору, чтобы сформировать маленькие определенные ГК олигосахариды. Использование похожего пмЦС мутанта (например GalNAc-Tase) в одном из шагов позволило происходить формированию смешанных олигосахаридов при использовании UDP-GlcNAc. Биологическая активность и терапевтический потенциал маленьких ГК олигосахаридов - сложная область для исследования, которая потребует определенных, монодисперсных сахаров для однозначной интерпретации.

Заключение

Очевидно, существуют два различных класса ГК синтаз. Наиболее хорошо охарактеризован фермент класса II вида Рasteurella, удлинняющий цепь ГК повторяющимся присоединением одиночного сахара на невосстанавливающийся конец цепи ГК. Направление и способ работы синтаз класса I (стрептококковые, вирусные и ферменты позвоночных) остаются неясными. Относительно прикладных наук, способность пмГКС удлиннять экзогенно расположенные акцепторные молекулы полезна для создания новых молекул и/или устройств с потенциальным медицинским применением.