Acidul hialuronic (hialuronatul) este unul dintre cele mai importante componente ale structurilor țesuturilor extracelulare, o substanță care face parte din majoritatea fluidelor biologice și care îndeplinește o serie de funcții vitale în corpul uman. În corpul unui tânăr care cântărește 70 kg, sunt prezente aproximativ 15 g din acest compus. Mai mult, mai mult de o treime din rezervele sale suferă o transformare (sinteză sau defalcare) în fiecare zi.

S-a dovedit că în timp, concentrația de acid hialuronic din organism scade. De exemplu, în organele și țesuturile unei persoane care a atins vârsta de 50 de ani, acest compus este prezent cu 30-40% mai puțin decât în ​​corpul unui adolescent de 17 ani. Din acest motiv, nutriționiștii moderni recomandă ca fiecare persoană care a împlinit vârsta de 33–35 de ani să mărească aportul acestei substanțe din exterior, adică cu alimente.

Hialuronatul a fost izolat pentru prima dată de oamenii de știință K. Meyer și D. Palmer din corpul vitros al ochiului unei vaci în 1934. Structura chimică a acestui compus a fost determinată mult mai târziu - în a doua jumătate a secolului trecut. În ceea ce privește proprietățile medicale și biologice ale acidului hialuronic, studiul lor este încă în desfășurare.

Funcțiile biologice ale hialuronatului

Acidul hialuronic este o substanță vitală pentru oameni care îndeplinește o gamă largă de funcții biochimice. Până în prezent, s-a dovedit că acest compus:

• este cea mai importantă componentă a țesuturilor epiteliale, conjunctive și nervoase, fluidelor biologice;
• crește intensitatea metabolismului sodiului, potasiului, magneziului în celule;
• menține echilibrul optim al fluidelor în toate țesuturile corpului uman;
• previne îmbătrânirea prematură;
• accelerează procesele de regenerare prin activarea capacității de secreție a fibroblastelor (celulele care alcătuiesc țesutul conjunctiv);
• accelerează procesele de fuziune a țesutului osos în caz de fracturi și alte leziuni;
• dă consistență vâscoasă lichidului sinovial;
• creează condiții optime pentru proliferarea (diviziunea) și migrarea celulelor;
• îmbunătățește microcirculația sângelui;
• crește viteza de transport al nutrienților în întregul organism;
• protejează organele și țesuturile de leziuni cauzate de compresie;
• oferă protecție pielii de efectele negative ale razelor directe ale soarelui;
• stimulează procesele responsabile de sinteza elastinei și colagenului;
• are un efect antiinflamator pronunțat;
• este una dintre componentele care alcătuiesc cartilajul articular și asigură funcționarea lor normală;
• elimină consecințele intoxicației interne;
• protejează organismul de microbi (activează factorii bactericizi de pe suprafața plăgii și pe piele);
• modifică activitatea limfocitelor, întărind astfel imunitatea umană;
• este un antioxidant;
• promovează eliminarea structurilor celulare moarte și a deșeurilor celulare din organism;
• previne dezvoltarea unui număr de boli oftalmologice, este un element structural al corpului vitros al ochiului uman și face parte din alte elemente ale aparatului vizual, promovează trecerea razelor de lumină către retină, prevenind în același timp deformarea acestora;
• previne apariția tulburărilor articulare;
• este un modulator al contururilor faciale și corporale;
• are capacitatea de a reține umiditatea în piele, conferă pielii elasticitate, îi crește rezistența la influența factorilor adversi și previne apariția ridurilor legate de vârstă și ale feței;
• are un efect benefic asupra funcționării sistemului reproducător;
• participă la procesele de dezvoltare intrauterină și de creștere a fătului în timpul sarcinii.

Este de remarcat faptul că acest compus joacă, de asemenea, un rol semnificativ în procesul de fertilizare a ouălor. În mod normal, un ovocit eliberat din ovar în timpul perioadei de ovulație este acoperit cu două membrane protectoare (zona pellucida și corona radiata) care conțin o cantitate mare de hialuronat. Fertilizarea este posibilă numai dacă integritatea acestor membrane nu este ruptă. Când straturile protectoare sunt distruse, ovulul își pierde capacitatea de a fi fertilizat de spermatozoizi și moare. Cu alte cuvinte, aportul insuficient de hialuronat în organism poate provoca infertilitate feminină.

Ce produse contin acid hialuronic?

În tinerețe, corpul uman este capabil să sintetizeze acid hialuronic și să-și satisfacă independent nevoia de această substanță. Cu toate acestea, odată cu vârsta, producția acestui compus scade, iar deficiența acestuia începe să aibă un efect negativ asupra stării pielii, a articulațiilor și a funcționării organelor și sistemelor interne. Una dintre modalitățile de a elimina simptomele neplăcute care însoțesc lipsa de hialuronat este includerea în meniu a alimentelor bogate în această substanță sau compuși care stimulează producerea acesteia.

Produsele din carne sunt considerate principala sursă alimentară de acid hialuronic. Mai mult, cea mai mare cantitate din această substanță este prezentă în acele tipuri de carne (și mâncăruri preparate pe baza lor) care conțin o cantitate suficientă de articulații, tendoane, cartilaj și piele. De exemplu, puteți reface rezervele pierdute de hialuronat incluzând în mod regulat în meniu:

• bulion bogat de carne;
• carne fiartă sau înăbușită pe os;
• Jeleat din carne de curcan, porc, pui sau vita;
• orice fel de mâncare care conțin gelatină (jeleu, marmeladă, bezele etc.).

Este de remarcat faptul că alimentele vegetale sunt, de asemenea, o sursă bogată de acid hialuronic. În special, concentrații crescute ale acestei substanțe au fost găsite în boabele de soia, laptele de soia și legumele care conțin cantități mari de amidon. La sfârșitul secolului al XX-lea, în coaja strugurilor roșii au fost descoperite substanțe care stimulează producția de hialuronat. Drept urmare, vinurile roșii și sucul natural de struguri au fost incluse printre produsele vegetale care ajută la refacerea rezervelor acestui compus unic în corpul uman.

Cantități semnificative de acid hialuronic se găsesc și în unele plante medicinale. În special, frunzele și fructele de brusture, care sunt folosite pentru a prepara ceaiuri sănătoase și gustoase din plante, sunt recunoscute ca o sursă bogată a acestei substanțe.

Ce factori influențează sinteza și absorbția hialuronatului în organism?

Există mai mulți factori care pot avea atât efecte pozitive, cât și negative asupra proceselor de producție și absorbție a acidului hialuronic. De exemplu, sinteza acestui compus și digestibilitatea acestuia sunt semnificativ crescute odată cu consumul simultan de alimente îmbogățite cu acid ascorbic și rutină. Din acest motiv, nutriționiștii recomandă persoanelor care suferă de o lipsă de acid hialuronic să includă în alimentație cât mai des posibil următoarele alimente și feluri de mâncare:

• ceai verde;
• citrice (grapefruit-urile, portocalele și lămâile sunt cele mai bune);
• rowan;
• unele fructe de padure (mur, coacaze negre, zmeura);
• nuci;
• caise;
• cireșe;
• verdeturi (patrunjel, coriandru, marar);
• toate soiurile de varză;
• salata de frunze;
• măceșe și infuzii preparate pe baza acestuia;
• rosii.

În același timp, există factori care pot încetini semnificativ procesele de producție și absorbție a acidului hialuronic. Ele sunt principalele motive pentru dezvoltarea deficienței acestei substanțe în organism.

Lipsa acidului hialuronic și consecințele sale

Principalele motive pentru formarea deficienței de acid hialuronic în organism sunt:

• fumat;
• abuz de băuturi alcoolice cu tărie mare, consum de vin roșu în doze care depășesc limitele admise (mai mult de 140 ml în timpul zilei);
• aport insuficient de vitamina C, rutina și alți nutrienți;
• ședere excesiv de lungă în solar, sub influența razelor directe ale soarelui, refuzul de a folosi protecție solară;
• scăderea în funcție de vârstă a concentrației acestei substanțe în țesuturile corpului uman.

O deficiență a acestui compus poate duce la o gamă largă de efecte adverse. În special, semnele deficienței de hialuronat pot include:

• deteriorarea bunăstării generale, oboseală, indiferență față de evenimentele curente;
• slăbirea forțelor imunitare ale organismului, apariția frecventă a răcelilor;
• deshidratare, lasare, uscăciune excesivă a pielii;
• modificarea contururilor feței și corpului în rău;
• dezvoltarea bolilor dermatologice;
• deteriorarea vederii și apariția altor tulburări în funcționarea aparatului vizual;
• apariția precoce a ridurilor și a altor semne de îmbătrânire;
• dezvoltarea bolilor articulare și apariția altor patologii în sistemul musculo-scheletic;
• vindecarea prelungită a rănilor, fuziunea lentă a țesutului osos în fracturi;
• apariția semnelor de intoxicație a organismului;
• incapacitatea de a concepe un copil pentru o lungă perioadă de timp;
• apariția tulburărilor în dezvoltarea intrauterină a fătului, încetinind creșterea acestuia.

Dacă sunt detectate astfel de simptome, este necesar să vă reconsiderați dieta și să o îmbogățiți cu alimente bogate în acid hialuronic și substanțe care activează sinteza acestuia. În plus, este necesar să renunți la obiceiurile proaste și să te protejezi cât mai mult de efectele factorilor care afectează negativ producția acestui compus esențial.

Prima mențiune despre o polizaharidă neobișnuită cu o greutate moleculară mare, care a fost izolată din umoarea vitroasă a ochiului bovinului, a fost făcută în 1934 de biochimiștii germani Karl Meyer și John Palmer. Ei au fost cei care au propus denumirea noii substanțe acid hialuronic. Dar în 1918, Levene și Lopez-Suarez au izolat o polizaharidă constând din glucozamină, acid glucuronic și o cantitate mică de ioni de sulfat din corpul vitros și din sângele din cordonul ombilical. Atunci se numea mucoitină - acid sulfuric, dar acum s-a stabilit că era acid hialuronic, izolat cu un amestec de glicozaminoglicani sulfatați.

În următorii 10 ani, K. Meyer și o serie de alți oameni de știință au izolat acidul hialuronic din organele animalelor. În 1937, F. Kendall a izolat acidul hialuronic din capsulele streptococice.

Prima experiență de utilizare a HA în medicină datează din 1943, când medicul sovietic Nikolai Fedorovich Gamaleya a folosit-o în pansamente complexe pentru soldații Armatei Roșii degerați într-un spital militar. Extractul din cordonul ombilical, pe care l-a numit „factorul de regenerare”, a fost aprobat de Ministerul Sănătății al URSS ca medicament „Regenerator”. De asemenea, omul de știință maghiar Andre Balazs, din 1947, a studiat vâscozitatea HA în funcție de pH-ul și puterea ionică a soluției, descompunerea acesteia sub influența radiațiilor ultraviolete și, de asemenea, a studiat modul în care acidul hialuronic acționează asupra celulelor vii.

În prezent, hialuronanul ca obiect de cercetare poate fi găsit în biochimie, biofizică moleculară, bioorganică și chimia radiațiilor. Aspectele medicale includ studierea rolului acidului hialuronic în fertilizare, embriogeneză, dezvoltarea unui răspuns imunitar, vindecarea rănilor, cancerul și bolile infecțioase, procesul de îmbătrânire și în rezolvarea problemelor medicinei estetice. O gamă largă de aplicații practice ale acidului hialuronic promovează regenerarea epitelială, previne formarea țesuturilor de granulație, aderențe, cicatrici, reduce umflarea, reduce mâncărimea pielii, normalizează circulația sângelui, promovează cicatrizarea ulcerelor trofice și protejează țesuturile interne ale ochiului. Acidul hialuronic este folosit destul de bine în biochimia aplicată și enzimologia ca substrat pentru determinarea cantitativă a enzimelor hialuronidază.

Ce este exact acidul hialuronic? Este o moleculă lungă, neramificată, în care alternează reziduurile de acid D-glucuronic și N-acetilglucozamină. Fără a intra în detalii, observăm că ambele aceste substanțe sunt molecule de glucoză modificate. O moleculă de acid hialuronic poate conține mai mult de 30.000 de reziduuri din fiecare dintre aceste substanțe. În plus, în organism acest lanț este întotdeauna asociat cu o anumită cantitate de proteine. Interesant, o astfel de structură este universală și se găsește într-o mare varietate de reprezentanți ai lumii animale și chiar în unele bacterii. Acidul hialuronic aparține clasei de glicozaminoglicani.

Figura 1. Structura acidului hialuronic

Anterior, se foloseau metode pentru obținerea acidului hialuronic din corpul vitros al ochiului unei vaci și din pieptenele unui cocoș. Dezavantajele acestor metode de producție au fost costul lor ridicat și prezența impurităților proteice în produsul final, ceea ce a dus la un număr mare de reacții alergice la medicament.

Producția modernă de HA se bazează pe un proces de fermentație folosind bacterii (Streptococcus equi și Streptococcus zooepidemicus). HA obtinuta in acest fel are un grad mai mare de purificare, ceea ce explica tolerabilitatea mai buna a HA de catre pacienti. Biotehnologia producerii hialuronanului din tulpini bacteriene ale producătorilor implică cultivarea acestora în condiții selectate, în care, în stadiul de creștere logaritmică, se formează o capsulă de polizaharidă pe suprafața celulelor bacteriene, iar în stadiul staționar de creștere, HA poate fi secretat în lichidul de cultură, capsula devine mai subțire sau dispare complet.

HA este sensibil la hidroliza acido-bazică. Chiar și o ușoară acidificare a unei soluții de HA cu acid acetic duce la o scădere ireversibilă a vâscozității de 2,5 ori. HA este complet hidrolizată de acizii minerali la acid glucuronic, glucozamină, acid acetic și dioxid de carbon. Acidul sulfuric diluat hidrolizează acidul într-un timp scurt pentru a forma cristale de dizaharidă.

Depolimerizarea redox a hialuronanului . Distrugerea macromoleculei de polizaharidă sub influența mediilor redox are loc printr-un mecanism de radicali liberi. Radicalii liberi se formează cu participarea acidului ascorbic, hialuronanului și oxigenului. S-a dovedit că acidul hialuronic este depolimerizat prin acțiunea ionilor de fier în prezența acidului ascorbic. În consecință, HA izolat într-o atmosferă de azot sau argon are un grad mai mare de polimerizare comparativ cu cel izolat în aer.

Pentru uz medical este necesară sterilizarea soluțiilor de hialuronan. Se realizează prin autoclavare la o temperatură de 120-130ºС sau prin radiații gamma ionizante. În ambele cazuri, are loc o depolimerizare semnificativă a biopolimerului și pierderea activității sale terapeutice inițiale. Există metode cunoscute pentru protejarea soluțiilor de hialuronan de la depolimerizare, bazate pe adăugarea diferiților aminoacizi, acid boric și glicerină, sulfat de hidrochinolină, acid uric și compuși fenolici (pirogalol) la soluții.

Proprietățile caracteristice ale acidului hialuronic - activitatea sa biologică pronunțată, biocompatibilitatea excelentă, lipsa antigenicității, iritația și alte efecte secundare - au atras atenția oamenilor de știință. Datorită proprietăților sale fizico-chimice unice, HA și-a găsit aplicație în diverse domenii ale medicinei, cosmetologiei și medicinei veterinare. Faptul că HA este parte a multor țesuturi (piele, cartilaj, corp vitros) și este specific organului și nespecific speciei determină utilizarea sa în tratamentul bolilor asociate acestor țesuturi.

Funcțiile biologice ale acidului hialuronic pot fi împărțite în „pasive” și „active”. Ca material inert, HA este implicat în homeostazia tisulară, în reglarea sterica (osmoză) a pătrunderii oricăror substanțe, acționează ca un „lubrifiant” care îmbunătățește mobilitatea articulațiilor etc. Funcțiile „active” ale HA constau în legarea specifică la proteinele din matricea extracelulară și de pe suprafața celulei. Această interacțiune joacă un rol important în formarea țesutului cartilaginos, în procesele de proliferare celulară, în morfogeneza și dezvoltarea embrionară a animalelor, precum și în mecanismele de inflamație și cancer.

Acidul hialuronic este utilizat în oncologie ca agent terapeutic. Mecanismele de acțiune ale GC asupra celulelor tumorale sunt variate. La nivel molecular, mecanismul este că HA cu greutate moleculară mare, prin legarea de receptorii de pe membrana celulară a celulelor tumorale, încetinește migrarea acestora și formarea metastazelor. Al doilea mecanism de acțiune este că administrarea de HA cu greutate moleculară mare promovează formarea unei capsule de țesut conjunctiv în jurul tumorii. Al treilea mecanism este asociat cu proprietatea fracțiunii cu greutate moleculară mare de a inhiba vascularizarea tumorii (creșterea vaselor de sânge în tumoră) și, prin urmare, duce la o încetinire a creșterii tumorii și a metastazelor, în timp ce fracția cu greutate moleculară mică, dimpotrivă. , induce.

Acidul hialuronic s-a dovedit destul de bine în vindecarea rănilor de arsuri, ulcerelor, cicatricilor și intervențiilor postoperatorii. Oamenii de știință au descoperit că nu are un efect iritant, ci, dimpotrivă, provoacă un efect antiinflamator și favorizează regenerarea rapidă a țesuturilor. Într-un experiment, un bioexplant (film) bazat pe HA oxidat a arătat o vindecare accelerată a suturilor anastomotice intestinale cu risc ridicat.

HA sunt utilizate la prepararea compozițiilor farmaceutice ca agenți de îngroșare, lubrifianți, agenți pentru acoperiri cu film rezistente la sucul gastric, în special la prepararea capsulelor, gelurilor, coloizilor și diferitelor dispozitive (de exemplu, lentile de contact, articole de tifon etc.) . Probabil, mecanismul de acumulare a unui număr de medicamente și antibiotice în structurile țesutului conjunctiv se bazează pe legarea lor de proteoglicanii tisulari. Același lucru se poate spune despre mecanismele de depunere în țesuturi, în special în matricea țesutului conjunctiv, a diverșilor produse patologice. În mod normal, în prima zi de vindecare a rănilor, are loc o creștere a concentrației de HA, care se leagă de rețeaua de fibrină și formează o matrice de tranziție care stimulează activarea și migrarea granulocitelor, macrofagelor și fibroblastelor, precum și proliferarea celulelor epiteliale. . În plus, HA, prin intensificarea fagocitozei, promovează o curățare mai completă a plăgii de elementele necrotice. Datorită activității crescute a macrofagelor, crește formarea factorului trofic, care atrage fibroblastele și celulele endoteliale în zona afectată.

Conținutul de hialuronan din pielea umană nu este constant. Există fluctuații sezoniere minore ale HA în dermă: vara nivelul de hialuronan este puțin mai scăzut decât iarna. Acest lucru este asociat cu o rată crescută de degradare a HA sub influența radiațiilor UV. Se observă cea mai semnificativă scădere a concentrației de GC legată de vârstă. Începând de la vârsta de 60 de ani, are loc o scădere multiplă a concentrației de HA în derm. Prin urmare, injectarea intracelulară de HA nativ pare a fi o modalitate complet naturală de a inflama deficiența acestuia. Această metodă de injectare în medicina estetică se numește biorevitalizare.

În literatura științifică puteți găsi informații extinse despre structura chimică, caracteristicile macromoleculare, proprietățile biologice și utilizările medicale ale acidului hialuronic.

HA face parte din principala substanță intercelulară a țesuturilor conjunctive, epiteliale și nervoase; este prezentă în cantități mari în corpul vitros al ochiului, lichidul sinovial al articulațiilor, pielea, pereții arterelor și venelor, valvele cardiace și glomerulare. membrana bazală a rinichilor.

De la descoperirea acidului hialuronic, a existat o evoluție semnificativă a opiniilor. Dacă la început s-a crezut că această polizaharidă servește ca o componentă structurală pasivă a matricei intercelulare, atunci până acum este implicată în multe procese biologice: de la reproducere, migrare, diferențierea celulelor în timpul embriogenezei până la reglarea inflamației și vindecarea rănilor, metastaze ale celulelor canceroase. În organism, HA îndeplinește multiple funcții fiziologice: servește ca bază pentru funcționarea sistemului corporal, determină permeabilitatea țesuturilor și vaselor sistemului circulator și rezistența la infecții. Dar odată cu vârsta, toate funcțiile încetinesc.

O astfel de mare varietate de proprietăți biologice ale acidului hialuronic se datorează funcției de greutate moleculară, care joacă un rol semnificativ în comportamentul celular, polimorfismul formelor structurale și proprietățile fizico-chimice ale moleculelor cu greutăți moleculare diferite, în funcție de mediul ionic și concentrația de biopolimerul din țesuturi și organe.

Pentru a rezuma, putem spune că acidul hialuronic și-a găsit utilizarea în multe ramuri ale medicinei. Este folosit in injectii cosmetice (biorevitalizare) si este inclus in diverse produse cosmetice. Trebuie remarcat faptul că HA poate avea și consecințe negative atunci când este injectată frecvent sub piele. Pentru a-ți menține tonul pielii, trebuie să duci un stil de viață sănătos, să mănânci corect și să nu abuzezi de obiceiurile proaste. Oftalmologii îl folosesc și ca tratament pentru cataractă și sindromul de ochi uscat. În imunologie, este utilizat pentru tratamentul complex al stărilor de imunodeficiență datorate infecțiilor virale. Poate fi folosit și pentru tratarea ulcerelor gastrice și duodenale prin activarea tripsinei.

Bibliografie

1. Egorov E.A. Acid hialuronic: aplicare în oftalmologie și tratamentul sindromului de ochi uscat // Cancerul de sân. oftalmologie clinică. – 2013. – Volumul 13, Nr.2. S. – 72.
2. Sigaeva N.N., Kolesov S.V., Nazarov P.V., Vildanova R.R. Modificarea chimică a acidului hialuronic și utilizarea sa în medicină // Buletinul Universității Bashkir. – 2012. – T.17. Numarul 3. S. – 1221 – 1222.
3. Strelnikova L.N., Kleshchenko E.V., Astrin A.V. Chimie și viață // Revista lunară științifică și populațională. – 1.12.2010. nr. 12. S. – 22 – 23.
4. Khabarov V.N., Boykov P.Ya., Selyanin M.A. Acid hialuronic: producție, proprietăți, aplicare în biologie și medicină. – M.: Medicină practică, 2012. – 224 p.: ill. S. – 9 – 11, 19 – 30, 218.

Acidul hialuronic (hialoid = sticlos + uronic = acid) este o substanta apartinand grupului de polizaharide, sintetizata de celulele majoritatii organismelor vii, si este o componenta importanta a pielii, muschilor, nervilor si a altor tesuturi umane.

În descrierile compozițiilor produselor cosmetice, este uneori numit „hialuron”; biochimiștii folosesc mai des sintagma „hialuronat de sodiu”, deoarece în corpul uman este prezent în principal sub formă de sare de sodiu.

Rolul biologic

Acidul hialuronic este necesar pentru formarea substanței intercelulare, care este mediul de funcționare a celulelor: diviziunea lor, furnizarea de substanțe nutritive și îndepărtarea deșeurilor.

Jumătate din tot acidul hialuronic din organism se găsește în piele. Aici este o umplere naturală a golurilor dintre elementele fibroase ale pielii - colagen și elastina și participă la sinteza acestora.

Acidul hialuronic este implicat și în procesele de vindecare a rănilor, afectează reacțiile imune, blochează efectul radicalilor liberi asupra celulelor, protejând țesuturile de îmbătrânirea prematură.

Una dintre cele mai importante proprietăți ale acidului hialuronic este cea mai mare hidrofilitate a acestuia - capacitatea de a lega umiditatea. O moleculă poate conține până la 500 de molecule de apă. Chiar și o soluție apoasă 1% de acid hialuronic nu mai este un lichid, ci un gel vâscos.

La ce duce deficitul de acid hialuronic?

Odată cu vârsta, sub influența factorilor de mediu și a proceselor naturale de îmbătrânire, conținutul de acid hialuronic din corpul uman scade; până la vârsta de 50 de ani, cantitatea acestuia se reduce la jumătate. Scăderea concentrației g.c. în piele duce la deshidratare, o scădere a sintezei de colagen și elastină în ea, care se manifestă sub formă de uscăciune, lasare și apariția ridurilor.

Aplicație în cosmetologie

În cosmetologia modernă, acidul hialuronic este folosit ca componentă principală a preparatelor pentru hidratarea pielii. O substanță mai eficientă în acest scop nu a fost încă găsită.

Deoarece acidul hialuronic nu este o substanță străină pentru organism, preparatele pe bază de acesta sunt hipoalergenice.

Acidul hialuronic folosit în cosmetologie poate fi de origine naturală sau artificială. Deoarece metabolismul său este foarte activ (molecula gk „trăiește” în organism timp de 2-3 zile, apoi este distrusă și una nouă este sintetizată de către celule), substanțe sintetizate artificial, care se remarcă prin faptul că conțin molecule g , sunt mai des folosite pentru introducerea în straturile profunde ale pielii. „Cusute” împreună și corpul are nevoie de mai mult timp pentru a le descompune.

În produsele de uz extern (creme, emulsii, loțiuni etc.), acidul hialuronic acționează ca un hidratant. Pelicula cea mai subțire formată pe suprafața pielii previne evaporarea excesivă a apei și reține umiditatea necesară. În același timp, nu înfundă porii pielii, nu perturbă schimbul transcutanat de gaze și favorizează pătrunderea mai profundă a altor substanțe active incluse în produs. Dar, aplicat pe suprafața pielii, acidul hialuronic nu pătrunde în straturile sale mai profunde și oferă doar hidratare superficială, pe termen scurt.

Pentru hidratare profundă și pe termen lung, pentru stimularea fibroblastelor, se folosește introducerea acidului hialuronic în straturile profunde ale pielii - metoda biorevitalizare .

Preparatele cu o concentrație mare de acid hialuronic, sub formă de gel, sunt utilizate în chirurgie plastică de contur– pentru corectarea pliurilor nazolabiale, ridurilor, marirea volumului buzelor.

Preparatele pentru mezoterapie folosesc proprietatea acidului hialuronic de a îmbunătăți pătrunderea în celule a altor substanțe introduse odată cu acesta.

Acidul hialuronic este folosit nu numai în cosmetologie, ci face parte din medicamentele utilizate pe scară largă în multe domenii ale medicinei - oftalmologie, cardiologie, transplantologie, chirurgie etc.

La sfârșitul anilor 80 ai secolului XX, medicii au observat că procesul de vindecare a rănilor în perioada prenatală are loc oarecum diferit decât după naștere. Pentru tratarea malformațiilor congenitale s-au efectuat operații chirurgicale la fetuși localizați în interiorul corpului gravidelor (la 2-6 luni de sarcină). După naștere, pe corpurile acestor copii nu au fost găsite urme ale operațiilor efectuate. Oamenii de știință explică acest lucru prin concentrația foarte mare de acid hialuronic din corpul fetal și prin lichidul amniotic din jurul acestuia.

Acidul hialuronic!Se vorbeste mult despre el;este inclus in formulele noilor produse de ingrijire a pielii. Toți producătorii de produse cosmetice pretind că folosesc cele mai bune tipuri de acid hialuronic în produsele lor. Dar ce este acidul hialuronic, ce face, cum funcționează și ce tip este considerat cel mai bun?

Acidul hialuronic (HA) este cel mai important factor de hidratare a pielii. Această moleculă formează o rețea tridimensională care acționează ca un burete și prinde literalmente apa în jurul și în interiorul pliurilor sale.

În plus, HA este folosit de organism ca lubrifiant în articulații, auriculul este compus în principal din acesta și este, de asemenea, unul dintre polimerii structurali ai corpului vitros al ochiului. HA poate stimula sau inhiba inflamația, poate promova vindecarea rănilor și refacerea pielii. Este o componentă importantă a substanței intercelulare a literalmente întregului țesut conjunctiv al corpului uman.

În piele, HA se găsește în primul rând în membrana bazală a epidermei și a dermei, menținând spațiul dintre celule, hidratând și facilitând trecerea nutrienților.

Corpul unei femei care cântărește 60 kg conține aproximativ 13 g de acid hialuronic, 4,3 g din această cantitate sunt procesate și reînnoite în fiecare zi.

Cu toate acestea, înainte de a discuta cum funcționează HA și ce poate face pentru piele, ar fi o idee bună să prezentați mai întâi un scurt dosar despre această substanță pentru a înțelege mai bine modul ei de acțiune.

Acid hialuronic 101

Hialuronanul sau acidul hialuronic este un polimer natural, adică o moleculă mare formată din multe molecule mici repetate numite „subunități”.

În cazul acidului hialuronic, această subunitate este dizaharida acidului D-glucuronic și N-acetil-D-glucozamina legate între ele.

Lungimea unei molecule de HA poate varia de la 2 la 25 de mii de dizaharide. Greutatea moleculară a acestui polimer natural variază între 800 și 2.000.000 de daltoni (Da), cu o greutate moleculară medie de HA de 3 MDa în articulații și aproximativ 2 MDa în piele.

Organismul sintetizează și descompune continuu HA (după cum am menționat mai sus, organismul înlocuiește complet HA aproximativ la fiecare trei zile). Pe măsură ce moleculele mari de HA se degradează treptat, se formează fragmente cu greutăți moleculare foarte diferite. Un set din aceste fragmente - de la 800 Da la 2 MDa - este prezent în orice moment în țesuturile normale.

Pe baza mărimii moleculelor de HA, acestea sunt împărțite în diferite fracții.

• Greutate moleculară foarte mare: 3–20 MDa.
• Greutate moleculară mare: ~ 2 MDa.
• Greutate moleculară medie: ~ 1 MDa.
• Greutate moleculară mică: ~300 kDa.
• Greutate moleculară foarte mică: ~60 kDa.
• Oligomeri: de la 800 Da la 10 kDa.

Aspectul și efectele biologice

Este clar că moleculele, a căror masă moleculară poate varia de până la 12.500 de ori, arată și se comportă complet diferit în sistemele biologice, producând efecte biologice diferite. Acest lucru a fost demonstrat mai detaliat în numeroase studii efectuate în ultimii ani.

Se spune în mod obișnuit că HA poate absorbi de 1000 de ori propria greutate în apă. Cu toate acestea, acest lucru se aplică numai HA cu greutate moleculară mare, iar cei cu o greutate moleculară mai mică sunt în mod evident capabili să absoarbă mult mai puțină apă.

Prin urmare, în practică, dacă luați 1% HA cu greutate moleculară mare în apă, puteți obține un lichid sau un gel lichid destul de vâscos. HA cu greutate moleculară mică la aceeași concentrație va fi un lichid mult mai puțin vâscos sau un gel complet apos, în timp ce oligomerul va fi la fel de lichid ca apa. Inutil să spun că HA cu o greutate moleculară de 20 MDa va fi un gel foarte gros în acest caz.

S-ar putea să vă întrebați de ce există atât de multe informații despre dimensiunea moleculelor și aspectul gelului. Raspunsul este destul de interesant. HA cu o greutate moleculară de 3-20 MDa, adică HA cu greutate moleculară mare, este tipul de HA găsit în celulită. Aceasta este o dimensiune anormal de mare a moleculelor de HA, datorită căreia apa este reținută ferm în țesutul adipos subcutanat, care, la rândul său, contribuie la manifestarea semnelor vizibile de celulită.

Prin urmare, prezența HA cu o greutate moleculară prea mare în țesuturi este nedorită - acesta este un semn al unui proces patologic. Pe de altă parte, prezența prea multor fragmente de HA în țesuturi, adică prea mulți oligomeri sau chiar 20 kDa HA, este de asemenea nedorită, deoarece se știe că stimulează inflamația. Cu toate acestea, chiar și inflamația are dreptul să existe în unele situații și, uneori, este necesară (de exemplu, atunci când se vindecă rănile).

Toate celelalte greutăți moleculare (50 kDa - 2 MDa) par a fi neutre sau benefice, 2 MDa fiind considerate cele mai „normale” (ca să spunem așa) și inhibă inflamația.

Deci putem spune că singurul tip de HA cu adevărat „rău” este HA cu greutate moleculară extrem de mare, care favorizează și fibroza.

Dieta, stilul de viață și acidul hialuronic

Se crede că o dietă bogată în legume (magneziu) și fructe (acid ascorbic) ajută la creșterea sintezei naturale de GC a organismului. De asemenea, unele alimente sunt bogate în HA sau precursorii săi. Exemplele includ bulionul de oase, carnea de organe și cartilajul articulațiilor.

Hialuronanul poate fi administrat și pe cale orală ca supliment alimentar și ajunge efectiv la piele și articulații pentru a ajuta la creșterea hidratării, pentru a le menține să arate tinere mai mult timp și pentru a menține sănătatea. Acest lucru este similar cu administrarea orală de colagen hidrolizat, care ajută, de asemenea, la întârzierea îmbătrânirii pielii și la menținerea fermității și elasticității ligamentelor și tendoanelor.

Radiațiile ultraviolete reduc conținutul de HA al pielii, ceea ce duce la uscăciune și inflamație. Asigurând pielii o cantitate suficientă de HA vara, inclusiv din interior, putem fi siguri că va putea rămâne hidratată și protejată de razele solare.

Nu există un aliment specific care să aibă capacitatea dovedită de a crește sinteza proprie de HA a organismului, dar consumul zilnic de o anumită cantitate de apă potabilă va promova hidratarea, deoarece molecula de apă nu este mai puțin importantă pentru aceasta decât acidul hialuronic, deoarece fără apă, hialuronanul. este absolut inutil. În mod ideal, ar trebui să bei doi litri de apă pe zi. Astfel, pentru a îmbunătăți hidratarea pielii și a obține un efect de întinerire, este indicat să combinați utilizarea orală a HA sub formă de suplimente alimentare și consumul unei cantități suficiente de apă. Pentru rezultate maxime, puteți folosi suplimentar un ser, gel sau cremă de înaltă calitate care conține HA.

Absorbția dermică a HA din formulările cosmetice

Deoarece HA stimulează repararea și hidratarea pielii, iar pielea produce din ce în ce mai puțin din ea pe măsură ce îmbătrânim, este de la sine înțeles că doriți să adăugați niște HA în piele sub formă de ser de frumusețe, cremă sau gel.

Este clar că HA cu o greutate moleculară mare nici măcar nu va putea pătrunde în epidermă, în timp ce totul sub 300 kDa pătrunde în dermă și chiar în grăsimea subcutanată. Cu cât greutatea moleculară este mai mică, cu atât HA poate pătrunde mai adânc în piele.

Cu toate acestea, nu toate sunt atât de simple. După cum am menționat mai sus, trebuie să înțelegeți de ce folosim HA cu greutate moleculară mai mică în formularea noastră. Prin „împingerea” HA cu o greutate moleculară de 20 kDa în piele, nu rezolvăm toate problemele pielii, deoarece acest lucru poate fi atât benefic, cât și iritant pentru piele. Când se utilizează HA cu o greutate moleculară extrem de scăzută, lucrurile devin și mai complicate.

Cu toate acestea, majoritatea studiilor de cercetare au arătat că moleculele de HA cu o greutate moleculară undeva între 50 și 300 kDa pătrund bine în piele și au efecte benefice asupra acesteia. Experiența mea personală sugerează, de asemenea, că acesta este cel mai bun interval de greutate moleculară de utilizat.

HA cu o greutate moleculară de 1 MDa poate hidrata epiderma în sine, fără a pătrunde mai departe, în timp ce o moleculă cu o greutate moleculară de 2 MDa se așează pur și simplu pe suprafața epidermei și nu merge altundeva. Pe de altă parte, am constatat că HA de 10 kDa nu este la fel de benefic și poate fi iritant pentru piele în concentrații mari, așa cum este demonstrat în literatura științifică.

Această capacitate de absorbție diferită a HA, în funcție de greutatea sa moleculară, este motivul pentru care tot mai multe companii cosmetice folosesc acum HA cu greutăți moleculare diferite în formulările lor.

Moleculele de HA pot fi, de asemenea, liniare sau reticulate. Molecula liniară este HA standard găsită la oameni și în natură. HA reticulat este o invenție umană și este o formă mai stabilă de HA cu o capacitate de hidratare mai mare. Dar, din păcate, HA reticulat are o capacitate mai mică de a pătrunde în piele, deoarece molecula este „mai groasă” și nu poate traversa cu ușurință epiderma.

HA reticulat este folosit ca umplutură în mezoterapie, dar astăzi poate fi găsit și în unele creme anti-îmbătrânire.

Seruri, geluri și creme

Este destul de ușor să faci un ser sau un gel cosmetic folosind HA și apă. Cu toate acestea, cremele sunt o problemă diferită. Aici, HA poate crește foarte mult instabilitatea sistemului de emulsie. Prin urmare, majoritatea produselor HA de pe piață sunt geluri și seruri, care sunt mai ușor de obținut.

Multe produse cosmetice HA de pe piață conțin aproximativ 0,1% din această substanță, adică 1 parte HA și 999 părți apă și alte ingrediente. Cu toate acestea, produsele mai concentrate pot conține până la 2% HA. Concentrațiile mai mari nu sunt practice deoarece crema sau gelul devin prea groase și incomode.

Acidul hialuronic este în prezent unul dintre cele mai populare și importante ingrediente pentru îngrijirea pielii și a feței anti-îmbătrânire. Poate fi găsit și în unele produse de îngrijire corporală. Din păcate, cu excepția cazului în care tipul și concentrația de HA sunt menționate în mod specific pe ambalajul unui produs cosmetic, este foarte greu de înțeles ce anume este utilizat și în ce concentrații, dar acest lucru se aplică tuturor ingredientelor din formulările cosmetice.

Pe de altă parte, unele produse de îngrijire a pielii includ ingrediente active care cresc sinteza proprie de HA a pielii. Acest lucru dă un rezultat ușor întârziat, dar ocolește problema absorbției HA, deoarece „propriul” HA este sintetizat în piele. Alte substante active folosite in cosmetica pot inhiba actiunea enzimelor degradante de HA, hialuronidaze, in organismul uman (majoritatea polifenolilor au aceasta activitate). Aceasta prelungește durata de viață utilă a HA în piele și suprimă degradarea sa precoce sau excesivă.

Care este originea HA pentru cosmetice?

Pe vremuri, HA de origine animală, obținut din urechi de porc sau din piepteni de cocoș, era folosit în cosmetică. Îmi amintesc că primul HA pe care l-am achiziționat pentru utilizare în produsele noastre în 2002 a fost derivat din purcei.

Astăzi, HA este produsă prin fermentație bacteriană, care produce o dimensiune moleculară standard de 2 MDa. Apoi este „tăiat” fie de enzime, fie prin hidroliză pentru a produce molecule mai mici. Același lucru se întâmplă și în corpul uman - HA cu o greutate moleculară de 2 MDa este tăiată în bucăți mai mici de enzimele numite hialuronidaze.

Hialuronidază și celulită

Uneori, pentru a distruge HA cu o greutate moleculară excesiv de mare, despre care am menționat mai sus, medicii injectează hialuronidază în țesut.

O astfel de utilizare a hialuronidazei este reducerea temporară a aspectului celulitei. Folosesc cuvântul „temporar” deoarece corpul uman poate restabili greutatea moleculară a HA nou sintetizat la 20 MDa în doar câteva zile.

Prin urmare, o soluție pe termen lung la celulită nu poate fi obținută cu injecții cu hialuronidază. Acestea ar trebui să fie măsuri care vizează în primul rând reducerea retenției de apă în țesuturi și reducerea sintezei de HA cu o greutate moleculară de 20 MDa. Dar asta e o poveste pentru alt articol...

Concluzie

Pe masura ce inaintam in varsta, corpul uman sintetizeaza din ce in ce mai putin HA, motiv pentru care este necesara protejarea HA existenta si cresterea continutului acestuia in piele.

Acest lucru se poate face prin evitarea expunerii excesive la soare; cu o dietă bogată în legume, ierburi și organe; bea suficientă apă; folosind produse cosmetice bune de îngrijire a pielii pe bază de HA, cu molecule de diferite greutăți moleculare, în mod ideal de la 50 la 300 kDa.

Suplimentele alimentare cu acid hialuronic ajută și ele pentru că au de fapt un efect benefic asupra pielii (și articulațiilor), ajutând la hidratarea și hrănirea organismului din interior spre exterior.

Acidul hialuronic [HA] se găsește în matricea extracelulară a țesuturilor vertebrale, în învelișul de suprafață al anumitor specii de Streptococcus și agenți patogeni bacterieni Pasteurella și pe suprafața unor alge marine parțial infectate cu virus. Sintazele acidului hialuronic [HAS] sunt enzime care polimerizează HA folosind precursori de zahăr UDP care se găsesc în membranele exterioare ale acestor organisme. Au fost identificate genele GCS din toate sursele menționate mai sus. Se pare că există două clase distincte de GCS bazate pe diferențele în secvența de aminoacizi, topologia membranei prezisă și mecanismul de reacție propus.

Toate GCS au fost identificate ca sintaza de clasa I, cu excepția GCS la speciile Pasteurella. A fost de asemenea explicat modul catalitic de funcționare al singurului GCS de clasă II (pmGCS). Această enzimă extinde acceptorii externi de oligozaharide ataşaţi HA prin adăugarea de unităţi individuale de monozaharide la capătul nereducător pentru a forma polimeri lungi in vitro; nici un GCS Clasa I nu are această capacitate. Modul și direcția polimerizării HA catalizate de clasa I GCS rămân neclare. Enzima PMGC a fost, de asemenea, analizată pentru cele două activități ale sale: GlcUA transferaza și GlcNAc transferaza. Astfel, două situsuri active există într-o polipeptidă PMGC, respingând dogma larg acceptată a glicobiologiei: „o enzimă, un zahăr modificat”. Dovezile preliminare sugerează că enzimele de clasa I pot avea, de asemenea, două locuri de activitate.

Potențialul catalitic al enzimei PMGC poate fi utilizat pentru a crea noi polizaharide sau oligozaharide inginerești. Cu atât de multe tratamente medicale potențiale pe bază de GC disponibile, această tehnologie chimioenzimatică promite să beneficieze de căutarea noastră pentru o sănătate bună.

Cuvinte cheie

Acid hialuronic (HA), condroitină, glicoziltransferază, sintază, cataliză, mecanism, polizaharide himerice, oligozaharide monodisperse

Introducere

Hialuronanul [HA] este un glicozaminoglican foarte bogat la vertebrate, având atât roluri structurale, cât și de semnalizare. Anumite bacterii patogene, și anume grupele A și C ale speciilor Streptococcus și tipul A de Pasteurella multocida, produc o acoperire extracelulară de HA numită capsulă. La ambele specii, capsula HA este factorul de toxicitate care oferă bacteriilor rezistență la fagocite și complementaritate. Un alt organism care produce HA este algele marine Chlorella, care este infectată cu un anumit virus ADN dublu catenar mare, PBCV-1. Rolul HA în ciclul de viață al acestui virus nu este încă clar în acest moment.

Ilustrația 1. Reacția de biosinteză a HA.

Enzimele din clasa glicoziltransferazelor care polimerizează HA se numesc GC sintaze (sau GCS), conform vechii terminologii care include și sintetaze GC. Toate sintazele HA cunoscute sunt variante ale unei singure polipeptide responsabile de polimerizarea lanțului de HA. Precursorii de zahăr UDP, UDP-GlcNAc și UDP-GlcUA sunt utilizați de sintazele GC în prezența unui cation divalent (Mn și/sau Mg) la pH neutru (Fig. 1). Toate sintazele sunt proteine ​​legate de membrană în celula vie și se găsesc în fracțiunea de membrană după liza celulei.

Între 1993 și 1998, sintetazele GK din grupele A și C ale Streptococului [spGCS și, respectiv, seGCS], sintaza GK de vertebrate [GCS 1,2,3], sintaza GK al virusului algelor [svGCS] și, de asemenea, sintaza GK de tip A a specia Pasteurella multocida [pmGKS]. Primele trei tipuri de sintetaze GK par a fi foarte asemănătoare ca dimensiune, secvență de aminoacizi și topologia membranei prezisă. În schimb, sintaza GK din speciile Pasteurella este mai mare și are o secvență semnificativ diferită și o topologie prezisă față de alte sintetaze. Prin urmare, am emis ipoteza existenței a două clase de HA sintetaze (Tabelul 1). Enzimele de clasa I includ proteine ​​streptococice, vertebrate și virale, în timp ce proteina speciei Pasteurella este în prezent singurul membru al clasei II. Avem, de asemenea, unele dovezi că procesele catalitice ale enzimelor de clasa I și clasa II sunt diferite.

Tabelul 1. Două clase de sintetaze GK:

Deși Pasteurella spp. GK sintaza a fost ultima enzimă care a fost descoperită, mai multe caracteristici ale pmGXS au contribuit la progrese semnificative în studiul său în comparație cu unii membri ai enzimelor de clasa I, care au fost studiate timp de patru decenii. Caracteristica cheie a pmGCS, care a făcut posibilă clarificarea direcției moleculare de polimerizare și identificarea celor două situsuri active ale sale, este capacitatea pmGCS de a extinde oligozaharida acceptor localizată extern. pmGCS recombinant adaugă monozaharide individuale într-o manieră repetitivă la o oligozaharidă asociată GC in vitro. O caracteristică intrinsecă a fiecărui transfer de monozaharide este responsabilă pentru formarea unei repetări alternative a dizaharidelor în acel glicozaminoglican; nu este necesară formarea simultană a unității dizaharidice. Pe de altă parte, nu a fost demonstrată o astfel de extindere a acceptorilor externi pentru nicio enzimă de clasă I. Prin cercetarea științifică de bază, am dezvoltat acum câteva aplicații biotehnologice ale unei clase remarcabile de proteine ​​​​GK sintazei din specia Pasteurella.

Materiale și metode

Reactivi

Toți reactivii pentru studiile de biologie moleculară fără marcaj special au fost de la Promega. Oligonucleotidele standard au fost de la Great American Gene Company. Toți ceilalți reactivi de puritate ridicată, dacă nu este menționat altfel, au fost de la Sigma sau Fisher.

Trunchierea pmGCS și a mutanților punctiform

O serie de polipeptide trunchiate au fost produse prin amplificarea insertului pPm7A prin reacția în lanț a polimerazei cu polimerază Taq (Fisher) și primeri oligonucleotidici sintetici corespunzători diferitelor părți ale PMGC-urilor, cu un cadru de citire deschis. Ampliconii au fost apoi donaţi în plasmida de expresie pKK223-3 (promotorul tac, Pharmacia). Construcțiile recombinante rezultate au fost transformate în celule TOP 10F" din tulpina Escherichia coli (Invitrogen) și crescute pe mediu LB (Luria-Bertani) cu selecție de ampicilină. Mutațiile au fost făcute folosind metoda de mutageneză direcționată pe situs QuickChange (Stratagene) cu pKK/pmGCS plasmidă ca probă de ADN.

Prepararea enzimelor

Pentru a prepara membrana care conține pmGKC recombinant de lungime completă, pmGK1-972 a fost izolat din E. coli așa cum s-a descris. Pentru proteinele pmGKS trunchiate solubile, pmGKS1-703, pmGKS1-650 și pmGKS1-703 - care conțin mutanți, celulele au fost extrase folosind reactivul de extracție a proteinelor bacteriene B-PerTM II (Pieree) conform instrucțiunilor producătorului, cu excepția faptului că procedura a fost efectuată la 7°C în prezența inhibitorilor de protează.

Căi enzimatice pentru polimerizarea HA. modificarea GlcNAc sau modificarea GlcUA

Au fost concepute trei variante pentru a detecta dacă (a) are loc polimerizarea lanțurilor lungi de HA sau (b) adăugarea unui singur GlcNAc la o oligozaharidă acceptor HA terminal GlcUA sau (c) adăugarea unui singur GlcUA la un HA terminal GlcNAc oligozaharidă acceptoare. Activitatea totală a GCS a fost evaluată pentru o soluție care conține 50 mM Tris, pH 7,2, 20 mM MnCl2, 0,1 M (NH4)2SO4, 1 M etilenglicol, 0,12 mM UDP-(14C)GlcUA (0,01 μCi; NEN), 0,01 μCi; NEN mM UDP-GlcNAc și un set diferit de oligozaharide HA obținute din testicule prin tratament cu hialuronidază [(GlcNAc-GlcUA)n, n= 4-10] la 30°C timp de 25 minute într-un volum de reacție de 50 μl. Activitatea GlcNAc-transferazei a fost evaluată timp de 4 minute în același sistem tampon cu un set diferit de oligozaharide GC, dar cu un singur zahăr ca precursor - 0,3 mM UDP-(3H)GlcUA (0,2 μCi; NEN). Activitatea transferazei GlcUA a fost evaluată timp de 4 minute în același sistem tampon, dar cu doar 0,12 mM UDP-(14C)GlcUA (0,02 μCi) și cu un set ciudat de oligozaharide GC (3,5 μg acid uronic) preparat prin expunere la acetat de mercur pe Streptomyces GK-liaza. Reacțiile au fost încheiate prin adăugarea de SDS la 2% (g/v). Produsele de reacție au fost separate de substraturi prin cromatografie pe hârtie (Whatman 3M) ​​cu etanol/sulfat de amoniu 1 M, pH 5 5, ca solvent principal (65:35 pentru evaluarea GCS și GlcUA-Tase; 75:25 pentru GlcNAc-Tase evaluare). Pentru a evalua HA, o probă de bandă de hârtie a fost clătită cu apă și asocierea zaharurilor radioactive în polimerul HA a fost detectată prin scintilație lichidă calculată folosind cocktail-ul BioSafe II (RPI). Pentru reacțiile de jumătate de test, proba și dungile de 6 cm din aval au fost numărate în incremente de 2 cm. Toate experimentele de evaluare au fost scalate pentru a fi liniare în ceea ce privește timpul de incubare și concentrația de proteine.

Cromatografie prin filtrare pe gel

Mărimea polimerilor HA a fost analizată cromatografic pe coloane Phenomenex PolySep-GFC-P 3000, eluarea a fost efectuată cu azotat de sodiu 0,2 M. Coloana a fost standardizată cu dextrani fluorescenți de diferite dimensiuni. Componentele radioactive au fost detectate folosind un senzor LB508 Radioflow (EG&G Berthold) și un cocktail Zinsser. În comparație cu evaluarea completă GC folosind cromatografia pe hârtie descrisă mai sus, aceste reacții de 3 minute au conținut de două ori concentrațiile de zahăr UDP, 0,06 μCi UDP-(14C)GlcUA și 0,25 nanograme din seria GC de oligozaharide. În plus, a fost utilizată adăugarea de acid etilen diamină tetracilic la fierbere (2 minute) (concentrație finală 22 mM) pentru a finaliza reacțiile în loc să se adauge SDS.

Rezultate și discuții

Utilizarea și specificitatea acceptorului GCS

Mai multe oligozaharide au fost testate ca acceptori pentru PMGKS1-972 recombinant (Tabelul 2). Oligozaharidele HA au fost obținute din testicule prin scindarea hialuronidază și alungite prin pmGCS utilizând zaharuri UDP adecvate eliberate. Reducerea cu borohidrat de sodiu nu interferează cu activitatea acceptorului. Pe de altă parte, oligozaharidele obținute din HA prin scindarea lază nu suportă alungirea; reziduurile terminale nereduse nesaturate deshidratate ale GlcUA necesită grupări hidroxil care pot atașa zahărul primit de la precursorul UDP. Prin urmare, extensia catalizată de pmGX are loc în cazul grupurilor terminale nereduse. Într-un număr de experimente paralele, au fost descoperite forme recombinante ale sintazelor de clasă I, spGCS și x1GCS, care nu extind acceptorii derivați de GC. Având în vedere direcția activității enzimelor de clasa I, au fost făcute rapoarte contradictorii și sunt necesare cercetări suplimentare.

Tabelul 2. Specificitatea acceptoarelor de oligozaharide PMGCS:

Interesant, pentamerul de sulfat de condroitină este un bun acceptor pentru PMGC. Alte oligozaharide înrudite structural, cum ar fi chitoteroza sau pentamerul heparosan, totuși, nu servesc ca acceptori pentru pmGCS. În general, pmGCS pare să necesite oligozaharide acceptoare care conțin GlcUA legate de p. Emitem ipoteza că locul de legare a oligozaharidelor este intermediar în lanțul de retenție a HA în timpul polimerizării.

Analiza moleculară a activității PMGCS transferazei: două situsuri active într-o singură polipeptidă

Capacitatea de a măsura două componente ale activității glicoziltransferazei GK sintetazei, GlcNAc transferaza și GlcUA transferazei, a fost posibilă prin analiza moleculară a pmGCS. Am observat că un scurt motiv de secvență duplicat: Asp-Gly-Ser (Aspartic k-ta-Glycine-Serine) a fost prezent în pmGCS. Dintr-o analiză comparativă a grupărilor hidrofobe ale multor alte glicoziltransferaze care produc polizaharide sau oligozaharide legate β, s-a sugerat că, în general, există două tipuri de domenii: regiunile „A” și „B”. PmGKS, o sintază de clasa II, este unică prin faptul că conține două domenii „A” (comunicare personală, B. Henrissat). S-a propus ca anumiți membri ai sintazelor GK de clasa I (spGCS) să conțină regiuni „A” unice și regiuni „B” unice. Diferiți mutanți de ștergere sau punctiform ai pmGCS au fost evaluați pentru capacitatea lor de a polimeriza lanțurile GC sau capacitatea lor de a adăuga un singur zahăr la o oligozaharidă acceptor GC (Tabelul 3). Pentru a rezuma, pmGCS conține două site-uri active diferite. Mutageneza motivului DGS aspartat (reziduul 196 sau 477) la ambele locuri a dus la pierderea polimerizării HA, dar activitatea celuilalt situs a rămas relativ neafectată. Astfel, activitatea duală a GC sintazei a fost convertită în două activități diferite de glicoziltransferază unică.

Tabelul 3. Activitatea pmGCS cu o regiune ștearsă sau o mutație punctuală.

Îndepărtarea ultimelor 269 de reziduuri din gruparea carboxil terminală a transformat o proteină de membrană slab exprimată într-una solubilă înalt exprimată. Examinarea secvenței de aminoacizi a proteinei PMGC în această regiune, totuși, nu dezvăluie caracteristici tipice ale structurii secundare care ar asigura interacțiunea directă a enzimei cu stratul dublu lipidic. Emitem ipoteza că gruparea carboxil terminală a enzimei catalitice pmGCS se acoperă cu aparatul de transport polizaharid legat de membrană al celulei bacteriene vii.

Prima regiune „A” a pmGCS, A1, este un pelvis GlcNAc, în timp ce a doua regiune „A”, A2, este un pelvis GlcUA (Fig. 2). Aceasta este prima identificare a două situsuri active pentru o enzimă care produce o heteropolizaharidă, precum și o dovadă clară că o enzimă poate transfera de fapt două zaharuri diferite. S-a găsit o enzimă diferită de tipul F din P. multocida, numită PMCS, care catalizează formarea unui polimer nesulfatat de condroitină. HA și condroitina sunt identice ca structură, cu excepția polimerului menționat mai sus, care conține N-acetilglucozamină în loc de GlcNAc. Atât pmGCS cât și pmCS sunt 87% identice la nivel de aminoacizi. Cele mai multe modificări ale reziduurilor sunt în regiunea A1, ceea ce este în concordanță cu ipoteza că această regiune este responsabilă pentru semnalizarea hexozaminei.

Ilustrația 2. Reprezentarea schematică a zonelor pmGCS.
Două domenii independente de transferază, A1 și A2, sunt responsabile pentru catalizarea polimerizării lanțului de HA. Adăugările repetate, secvențiale de zaharuri individuale construiesc rapid lanțul HA. Se pare că capătul carboxil al pmGCS interacționează într-un fel cu mașina de transport legată de membrană a celulei bacteriene.

Figura 3. Model de biosinteză GC utilizând pmGCS.
Zaharuri simple sunt adăugate la fiecare domeniu "A" într-o manieră repetată la capătul nereducător al lanțului HA. Precizia intrinsecă a fiecărei etape a activității transferazei menține repetarea structurii dizaharidei HA. Lanțul GC în curs de dezvoltare este probabil reținut de pmGC-uri în timpul catalizei printr-un situs de legare a oligozaharidelor.

Am demonstrat o semnalizare eficientă a unui singur zahăr de către pmGCS in vitro prin mai multe tipuri de experimente și, prin urmare, am emis ipoteza că lanțurile GC sunt formate prin adăugarea rapidă și repetată a unui singur zahăr de către sintaza de clasa II (Figura 3). Până în prezent, o linie de dovezi sugerează că enzima de clasa I posedă, de asemenea, două situsuri de transferază. S-a raportat că mutația reziduului de leucină 314 la valină în mmGCS1, parte a preregiunii GlcUA-tazei, transformă acest GCS de vertebrat într-o chito-oligozaharid sintază. Nu au fost identificate situsuri cu activitate corespunzătoare a transferazei GlcNAc.

Grefarea polimerilor cu polizaharide sintetaze: adăugarea de HA la molecule sau particule solide

Cercetările privind PMGC în laboratorul de cercetare au transformat înțelegerea sintazelor GC din tărâmul unor monștri dificili și încăpățânați asemănătoare animalelor la potențiali cai de bătaie biotehnologici. Pot fi formate noi molecule folosind capacitatea PMGC de a grefa lanțuri lungi de HA pe lanțuri scurte derivate de HA sau acceptori derivați de condroitină. De exemplu, captatorii utili pot consta din molecule mici sau medicamente cu lanțuri de oligozaharide de condroitină sau HA legate covalent (lungime de 4 zaharuri, de exemplu). Alternativ, lanțurile HA pot fi adăugate la un primer oligozaharid imobilizat pe o suprafață solidă (Tabelul 4). Astfel, lanțurile lungi de HA pot fi adăugate ușor substanțelor sensibile sau dispozitivelor delicate.

Într-o altă aplicație, pot fi formate noi polizaharide himerice deoarece utilizarea pmGCS de către acceptorul de oligozaharide nu este la fel de strictă ca specificitatea transferazei zaharide. Condroitina și sulfatul de condroitină sunt recunoscuți ca acceptori ai PMGC și sunt extinse prin lanțuri HA de diferite lungimi (Fig. 4). Dimpotrivă, PMCS este foarte omoloage cu condroitin sintetaza și recunoaște și extinde acceptorii GC cu lanțuri de condroitină. Moleculele himerice de glicozaminoglican sunt formate prin conținut de compuși naturali, specifici de legătură. Aceste polizaharide grefate pot servi la atașarea la o celulă sau un țesut care leagă HA de o altă celulă sau țesut care leagă condroitina sau sulfatul de condroitin. În anumite aspecte, glicozaminoglicanii grefați seamănă cu proteoglicanii, care sunt componente esențiale ale matricei în țesuturile vertebrate. Dar, din moment ce nu sunt prezenți linkeri proteici în polimerii himeri, problemele de antigenicitate și proteoliză care apar în jurul utilizării medicale a proteoglicanilor sunt eliminate. Riscul de transmitere a agenților infecțioși de către țesuturile extrase din animale la un pacient uman este, de asemenea, redus atunci când se utilizează polimeri himerici.

Tabelul 4. Grefarea HA inițiată de PMGC pe margele de poliacrilamidă. Amestecul de reacție conține PMGC purtând UDP-(14C)GlcUA și UDP-(3H)GlcNAc radiomarcate, precum și diverși primeri de zahăr imobilizați (acceptori legați prin aminare reductivă în perle amino). Granulele au fost spălate și încorporate radioactiv pe alte margele, măsurate prin calcule de scintilație lichidă. Lanțurile GC au fost grefate pe margele de plastic folosind un primer adecvat și pmGC-uri.

Figura 4. Reprezentarea schematică a structurilor polizaharide grefate. Pasteurella spp. GC sintaza sau condroitin sintaza va extinde anumiți alți polimeri la capătul nereducător in vitro pentru a forma noi glicozaminoglicani himeri. Sunt prezentate câteva exemple.

Sinteza HA monodispersă și oligozaharide legate de HA

Pe lângă adăugarea unui lanț polimeric mare de HA la moleculele acceptoare, PMGC-urile sintetizează anumite oligozaharide HA mai mici, variind de la 5 la 24 de zaharuri. Folosind o enzimă de tip sălbatic și diverse condiții de reacție, a fost preparată relativ ușor o oligozaharidă de HA care conține 4 sau 5 monozaharide extinse cu mai multe zaharuri în versiuni mai lungi, care sunt foarte adesea greu de obținut în cantități mari. Am descoperit că combinarea unui mutant GlcUA-Tase solubil și a unui mutant GlcNAc-Tase solubil în același amestec de reacție permite formarea unui polimer HA dacă sistemul este echipat cu un acceptor. În 3 minute s-a realizat un lanț de aproximativ 150 de zaharuri (-30 kDa). Orice mutant de sintetază nu va avea ca rezultat un lanț HA. Prin urmare, dacă controlul suplimentar al reacției se face prin combinarea selectivă a diferitelor enzime, zaharuri UDP și acceptori, atunci se pot obține anumite oligozaharide monodisperse (Fig. 5).

Figura 5. Prepararea anumitor oligozaharide.
În acest exemplu, o tetrasaharidă acceptor GC este extinsă printr-o singură unitate dizaharidă condroitină utilizând două etape cu un mutant imobilizat din specia Pasteurella sintetază (indicată prin săgeți albe). Produsul descris este o nouă hexazaharidă. Repetarea ciclului încă o dată produce o oligozaharidă, două cicluri produc o decasaharidă etc. Dacă acceptorul a fost conjugat anterior cu o altă moleculă (de exemplu, un medicament sau un medicament), atunci noul conjugat ar fi extins cu un lanț scurt de HA, condroitină sau hibrid după cum se dorește.

De exemplu, într-o variantă de realizare, un amestec de UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA și acceptor este circulat continuu prin bioreactoare separate cu sintetaze mutante imobilizate care transferă doar un singur zahăr. Cu fiecare ciclu de incubare al bioreactorului, o grupare diferită de zahăr este adăugată la acceptor pentru a forma oligozaharide mici specifice HA. Utilizarea unui mutant pmCS similar (de exemplu GalNAc-Tază) într-una dintre etape a permis formarea de oligozaharide mixte atunci când se utilizează UDP-GlcNAc. Activitatea biologică și potențialul terapeutic al oligozaharidelor mici de HA este un domeniu de cercetare provocator, care va necesita zaharuri specifice, monodisperse pentru interpretare fără ambiguitate.

Concluzie

Aparent, există două clase diferite de sintetaze GC. Cea mai bine caracterizată enzimă de clasă II din specia Pasteurella extinde lanțul HA prin adăugarea repetată a unui singur zahăr la capătul nereducător al lanțului HA. Direcția și modul de funcționare a sintazelor de clasa I (enzime streptococice, virale și vertebrate) rămân neclare. În ceea ce privește științele aplicate, capacitatea pmGCS de a extinde moleculele acceptoare situate exogen este utilă pentru proiectarea de noi molecule și/sau dispozitive cu potențiale aplicații medicale.